人胚胎干细胞饲养层的制备以及定向诱导分化为神经元样细胞的初步研究

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1、分类号UDCIU29616编号!Q2壁垒Z!!!垒Q2Q@；工．薄大擎论文题目硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION盆丝超益经丞搓纽胞的垫垄婴塞学科专业蝗废检验诊断堂作者姓名韭邀指导教师塑塞遮塾握答辩日期星Q!垒生鱼旦Z旦分类号墅2窆UDC616编号!Q2璺垒圣!!!垒Q2Q硕士学位论文人胚胎千细胞饲养层的制备以及定向诱导分化为神经元样细胞的初步研究APRELIMINARYSTUDYOFHESCFEEDERPREPARATIONANDDIRECTIoNALLYDIFFERENTIATINGINTONEURoN．L

2、IKECELLS作者姓名：张微指导教师：胡嘉波教授小组成员：许文荣教授钱晖教授孙晓春副教授申请学位：硕士学科专业：临床检验诊断学论文提交日期：2014年6月11日论文答辩日期：2014年6月7日学位授予单位：江苏大学学位授予日期：2014年6月答辩委员会主席：朱伟研究员评阅学位论文版权使用授权书江苏大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、中国学术期刊(光盘版)电子杂志社有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致，允许论文被查阅和借阅，同时授

3、权中国科学技术信息研究所将本论文编入《中国学位论文全文数据库》并向社会提供查询，授权中国学术期刊(光盘版)电子杂志社将本论文编入《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》并向社会提供查询。论文的公布(包括刊登)授权江苏大学研究生处办理。本学位论文属于不保密中学位论文作者签名：3长{致弦f牛年6月t；日独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中己注明引用的内容以外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方

4、式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：珉掳欠日期：如哆年f月，；日江苏大学硕士学位论文目的摘要制备一种简便实用的人胚胎干细胞(humanembryonicstemcells，hESCs)饲养层，并研究白藜芦醇体外诱导hESCs向神经元样细胞的分化。方法1、小鼠胚胎肝基质细胞系(KM3)经过10“g／rnL丝裂霉素一C处理，分别在．70。C矛II液氮中冻存15d、30d和60d后复苏。2、通过形态学、细胞增殖能力、细胞因子表达等实验来观察复苏后的KM3生物学活性，应用形态学、增殖率实验、碱性磷酸酶染

5、色等方法评价hESCs未分化特性和增殖潜能。3、hESCs常规消化后，经拟胚体悬浮培养4d，然后在添加了50M自藜芦醇的神经诱导液贴壁培养12d。4、通过倒置显微镜连续观察细胞形态，免疫荧光染色观察各个阶段特异性标志Nestin和NF-M的表达，实时定量PCR(RT-qPCR)和WesternBlot检测神经细胞阶段NF—M基因和蛋白的相对表达量。结果人胚胎干细胞饲养层的制备以及定向诱导分化为神经元样细胞的初步研究1、10pg／mL丝裂霉素．C处理的KM3液氮冻存60d，KM3形态变化不明显，呈长梭形，存活率为(84．60-M

6、．14)％，．70℃冻存60d，存活率为(66．40-J：2．88)％，细胞容易脱落，维持时间短，bFGF表达量明显降低；液氮冻存60dKM3饲养层上的人胚胎干细胞，呈典型的人胚胎干细胞鸟巢状结构，边缘界限清晰，分化率为(16．33±2．08)％，．70*(2冻存60d的KM3饲养层上的人胚胎干细胞分化率为(37．67±3．51)％。2、与对照组比较，5州白藜芦醇诱导后，神经元样细胞以贴壁团块为中心成放射状蜘蛛网样交织生长，细胞胞体饱满，立体感强，细胞多为两个以上突起，杂质细胞少，免疫荧光显示NF—M阳性表达，RT-qPCR和

7、WesternBlot检测到NF—M基因和蛋白的表达，并且与对照比较，差异有统计学意义(P

8、为神经元样细胞的初步研究objectiveABSTRACTToestablishasimpleandpractitalfeederforhumanembryonicstemcells(hESCs)，andinvestigatethedifferentionofhESCsint