柠檬酸合成酶基因与磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因转化苜蓿的研究

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1、西南大学硕士学位论文柠檬酸合成酶基因与磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因转化苜蓿的研究姓名：张丽申请学位级别：硕士专业：草业科学指导教师：玉永雄20110603摘要柠檬酸合成酶基因与磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因转化苜蓿的研究摘要紫花苜蓿(MedicagosativaL)是世界栽培历史最悠久、面积最大、利用最广泛的一种豆科牧草，被誉为“牧草之王”。在我国北方有大面积种植，而南方酸性土壤中铝毒的存在限制了苜蓿在该地区的推广，因而培育对铝耐受力强的苜蓿新品种是解决苜蓿在南方种植的重要措施。近年来，随着分子生物技术的不断发展及对植物耐铝机制研究的不断深入

2、，为我们使用分子手段培育耐铝苜蓿新品种奠定了基础。本研究以渝苜一号紫花苜蓿的15号植株和以此植株为材料转化了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因的P．83号植株为材料。采用农杆菌介导叶盘法，将柠檬酸合成酶(CS)基因分别转入这两种材料中，并对转化了CS基因植株、PEPC基因植株、CS．PEPC双基冈植株进行PCR及RT-PCR检测，鉴定目的基因的整合与转录表达情况，然后进行酶活测定，有机酸含量测定，有机酸分泌量测定及耐铝试验。本研究目前取得的主要研究结果如下：1通过遗传转化得到29个抗性植株，这些植株经过PCR检测得到6株转基因苗，其

3、中C．P．2、C-P．6、C．P．11、C-P．19为转化CS．PEPC双基因植株，CS4、CS．9为转化CS单基因植株。将经过PCR鉴定的6株转基因植株用RT-PCR检测显示均能在转录水平上表达，CS基因转录表达最强的是转双基因植株c．P．11和C．P．2，而PEPC基因表达最强的是转PEPC单基因植株P．83。2测定了不同转基因植株叶片CS活性及PEPC活性，结果显示；各类植株CS酶活性水平从高到低依次是转CS．PEPC双基因植株、转CS单基因植株和野生株，其中转CS．PEPC双基因植株C．P．2的CS活性最高，达0．0225／zm

4、olNADH／min／mgprotein，约为野生株的2．6倍；各类植株PEPC活性水平从高到低依次是转PEPC单基因植株、转CS．PEPC双基因植株和野生株，其中转PEPC单基因植株P．83的PEPC活性最高，达0．049／．tmolNAD／min／mgprotein，约是野生株的2倍，其次为转CS．PEPC双基因植株C．P．2，PEPC活性达0．0442／zmolNAD／min／mgprotein。3测定了不同转基因植株叶片和根尖有机酸含量，结果显示：对于叶片草酸含量、苹果酸含量和柠檬酸含量，与野生株相比，转基因植株有显著增加，而且

5、转CS．PEPC双基因植株高于转CS单基因植株，转CS单基因植株高于转PEPC单基因植株；对于根尖草酸含量，转CS．PEPC双基因植株和转CS单基因植株根尖草酸含量高于转PEPC单基冈植株和野生株，CS．PEPC双基因植株、CS单基因植株和PEPC单基因植株三者对提高根尖苹果酸和柠檬酸含西雨大学硕}：学位论文量无显著差异，但均显著高于野生株。4测定了根系有机酸分泌量，结果显示，当无铝处理时，各转基因植株根系有机酸分泌量无显著差异。当植株受铝胁迫时，各转基因植株之间的草酸分泌量无显著性差异，但均显著高于野生株；苹果酸分泌量从多到少的分别是

6、转PEPC单基因植株、转CS单基因植株和转CS．PEPC双基因植株；柠檬酸分泌量则是转CS．PEPC双基因植株比转CS单基因植株多，转PEPC单基因植株未被测出柠檬酸分泌。在受到铝毒害时，野生株也没有被测出苹果酸和柠檬酸的分泌。5耐铝性试验结果表明：当无铝处理时，各植株根伸长正常，伸长量无显著性差异，根尖不能被铬天青染色。当植株受铝胁迫时，各类植株根伸长量从长到短依次是转CS．PEPC双基因植株、转PEPC单基因植株和转CS单基因植株；根尖染色程度即根尖受害程度从大到小依次是转CS单基因植株、转PEPC单基因植株和转CS．PEPC双基因

7、植株，其中转双基因植株C-P．2在20／zM铝胁迫时根尖未见到受害。本试验的结论：PCR检测证明CS基因和PEPC基因能整合到紫花苜蓿基因组中，RT-PCR鉴定表明CS基因和PEPC基因均能有效在转基因苜蓿植株中表达，提高了相关酶的活性，增加了叶片和根尖的有机酸含量，增强根系有机酸的分泌量，从而提高了对铝的耐受能力。各类植株耐铝能力从强到弱依次是转CS．PEPC双基因植株、转PEPC单基因植株和转CS单基因植株，其中转双基因植株C．P．2耐铝能力最强。关键词：柠檬酸合成酶基因磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因转基因苜蓿有机酸耐铝性ⅡABSTRA

8、(了StudyonTransformationofCitrateSynthaseGeneandPhosphoenolPyruvateCarboxylaseGeneinMedicagoSativaL．Abst