牛磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶单克隆抗体的制备.pdf

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1、细胞与分子免疫学杂志(ChinJCellMolImmuno1)2015．31(6829·论著·文章编号：1007—8738(2015)06—0829—04牛磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶单克隆抗体的制备盛美蕾，张晓，张纬，张燕飞，王盈，戴一凡(南京医科大学江苏省异种移植重点实验室，南京医科大学卫生部抗体技术重点实验室，江苏南京210029)[摘要]目的制备牛磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)单克隆抗体(mAb)，并对其特异性进行初步鉴定。方法构建含PEPCK基因的重组质粒，将其转化大肠杆菌，并进行诱导表达，对表达产物PEPCK重组蛋白进行纯化，以PEPCK重组蛋白为抗原

2、，免疫BALB／c小鼠，取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤细胞，用间接ELISA筛选阳性克隆，获得稳定分泌抗牛PEPCKmAb的细胞株，并用Westernblot法，免疫组织化学染色和免疫沉淀鉴定其特异性。结果成功获得稳定分泌抗牛PEPCKmAb的杂交瘤细胞株。Westernblot法、免疫组织化学和免疫沉淀结果表明，该抗体能与牛PEPCK蛋白特异性结合。结论成功获得抗牛PEPCKmAb。[关键词]磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶；单克隆抗体；杂交瘤[中图分类号]Q813．2，R392-33[文献标志码]BSHENGMeilei，ZHANGXiao，ZHANGWei，Z

3、HANGYanfei，WANGYing，DAIYifanJiangsuProvincialKeyLaboratoryofXenotransplantation，MinistryofHealthKeyLaboratoryofAntibodyTechnique，NanjingMedicalUniversity，Nanjing210029，China【AbstractJOMectiveTopreparethemonoclonalantibodyagainstbovinephosphoenolpyruvatecarboxykinasefPEPCK)andcharacter

4、izenjsbiologicalfunctions．MetlmdsTherecombinantplasmidcontainingPEPCKgenewasconstructedandusedtotransfectEscherichiaco／i．AfterexpressioninductioninEcoli．therecombinantproteinPEPCKwaspurifiedandusedtoimmunizeBALB／cmice．AfterthespleenBcellsintheimmunizedmicewerefusedwithmurinemyelomacel

5、ls，thepositivecloneswereidentifiedandselectedbyindirectELISAfortiterdetermination．PEPCKmAbproducedbythepositivehybridomacelswasenrichedanditsbiologicalfunctionswereexaminedbyWesternblotting，immunohistochemistryandimmunoprecipitation．Results0RehybridomacelllinesteadilysecretingPEPCKmAb

6、wassuccessfullygenerated，namely3D36H．Westembloting．immunohistochemistryandimmunoprecipitationshowedthatthePEPCKmAbwasabletospecificallybindtobovinePEPCKprotein．ConclusionThebovinePEPCKmAbwaspreparedsuccessfullyandhadagoodabilityandspecificity．[Keywords]phosphoenolpyruvatecarboxykinase

7、；monoclonalantibody；hybridoma磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate正常情况下，PEPCK．C在骨骼肌中不表达或表carboxykinase，PEPCK)催化糖异生过程中的一个限达量很低。有研究表明，在骨骼肌中过量表达速反应，即由草酰乙酸转变为磷酸烯醇式丙酮酸的PEPCK—C的PEPCK—Cmus转基因小鼠的运动能力远反应J。细胞中有2种PEPCK的同工酶，分别分远高于对照小鼠，而且PEPCK—Cmus转基因小鼠全布在线粒体(phosphoenolpyruvatecarboxykinase-身的脂肪含量下降，不到

8、对照小鼠脂