紧密连接蛋白在脂多糖致急性肺损伤大鼠肺组织的表达

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1、·英文缩略语·8中国医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：日期：中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产

2、权单位属中国医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容(保密内容除外)，以采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：查歪生指导教师签名：j皇兰耋日期：2翌亟：尘：三!·中文论著摘要·紧密连接蛋白在脂多糖致急性肺损伤大鼠肺组织的表达刖再急性肺损伤(ALI)f1’是由各种肺内外致病因素引起的急性进行性呼吸衰竭。主要病理特征是弥漫性肺泡毛细血管膜损伤

3、、通透性增高和肺水肿。目前国内外学者认为肺泡一毛细血管膜通透性增高是其主要发病机制。内毒素直接或间接损伤肺泡上皮和肺血管内皮细胞，导致肺泡一毛细血管膜通透性增加。肺毛细血管内皮的孔径是肺泡上皮孔径的约4倍即肺泡上皮较肺毛细血管内皮更为致密，故研究肺泡上皮屏障有着更为重要的意义。TJ主要存在于上皮细胞和内皮细胞间的连接复合体中形成环绕细胞的物理屏障结构。重要的TJ有Zo．1和闭锁蛋白(Occludin)等【31。目前国内尚无关于ALI时紧密连接蛋白损伤的研究报道。我们探讨内毒素引起肺泡上皮细胞Zo．1和Occludin蛋白表达变化规律，以推测紧密连接蛋白在

4、ALI发生中的可能机制，并为早期ALI治疗提供理论依据。材料与方法一、实验材料1、实验动物SD(Sprague．Dawley)大鼠，雄性，体重220-2709，共30只。2、主要试剂LPS：E．coli，内毒素055．B5LPS；购于Sigma．Co。一抗：山羊抗鼠Occludin多克隆抗体，山羊抗鼠Zo．1多克隆抗体，美国SantaCruz公司。二抗：兔抗山羊抗体，胃蛋白酶，DAB显示剂。免疫组化试剂盒包括正常血清封闭液。源于北京中杉金桥生物技术有限公司。3、主要器材电热恒温培养箱：DNP．9262型。源于上海精宏实验设备有限公司。微波炉：WD．700

5、型。源于LG电子天津电器有限公司。显微镜：CX．41RF型。源于菲律宾。显微图像分析系统：MetaMorph／DPl0／BX41，由UIC／OLYMPUS，US／JP生产。多道生理信号采集处理系统RM6240BD型源于成都仪器厂制造。二、实验方法l、实验动物分组及动物模型制备30只SD雄性大鼠，随机分成3组：正常对照组，LPS4h组，LPS24h组，每组10只大鼠。10％水合氯醛(300mg／kg)腹腔注射麻醉大鼠后，暴露气管，实验组气管内滴注LPS0．5ml／kg(浓度为LPS200肛#m1)，对照组气管内滴注NS0．5ml／kg。LPS给予后观察4h

6、组为LPS4h组，观察24h组为LPS24h组，NS对照组观察24h。2、实验动物的观察和标本的采集当大鼠观察结束时，分别用10％水合氯醛(300mg／kg)腹腔麻醉。分离颈动脉，用套管针进行颈动脉插管。经压力换能器与多道生理信号采集处理系统相连，记录血压。然后，暴露气管并开胸，观察肺形态。在左心耳处剪约2mm小切口，于右室经肺动脉流出道插入肺动脉套管针，灌注加入肝素的生理盐水，直至将肺血管床冲洗干净，肺组织洁白。将左主支气管结扎，取左下肺组织(约lcm×lcmx0．5cm)浸泡固定于4％多聚甲醛中24h，常规脱水、包埋、制成蜡块，用于HE染色及免疫组化

7、染色。余下的左肺组织称湿重(W)后置60"C温箱，7天后称干重(D)，求得湿重／干重比(W仍)。3、肺组织常规病理分析肺组织腊块切成4岬切片后经不同浓度酒精梯度常规脱蜡至水，HE染色。4、Occludin，Zo．1在肺组织中的免疫组化染色肺组织蜡块切成41,tm切片后严格按免疫组化试剂盒说明书操作。以磷酸盐缓冲液(PBS)代替第l抗体作为阴性对照。结果通过图像分析，测出Oceludin，Zo．1表达的平均灰度A。三、统计学分析计量资料采用x+s表示，采用SPSSl3．0统计分析软件进行方差分析及q检验，2p<0．05为差异有统计学意义。结果一、肺组织的病

8、理改变NS对照组：肺脏大体观察无明显异常改变。光镜可见肺泡结构完整，未见明显病变