膀胱癌B细胞抗原受体（BCR）H链CDR3多样性分析

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1、单位代码10602学号2015011136分类号R34密级公开硕士学位论文膀胱癌B细胞抗原受体（BCR)H链CDR3多样性分析ThediversityoftheBCRH-chainCDR3repertoireinbladdercancerusinghigh-throughputsequencing学院：生命科学学院学科名称：生物学研究方向：生物化学与分子生物学年级：2015级研究生：侯姝芳指导教师：眭维国主任医师完成日期：2018年6月膀胱癌B细胞抗原受体（BCR）H链CDR3的多样性分析研究生:侯姝芳年级:2015级导师:眭维国主任医

2、师学科专业：生物学研究方向:生物化学与分子生物学摘要研究背景：膀胱癌（Bladdercancer）是一种较常见的恶性肿瘤，发病率呈逐年增长的趋势，治疗效果及预后差，严重危害人类的健康。其确切的发病机制尚未完全清楚，寻找新的生物学靶标用于膀胱癌的监测和干预，成为膀胱癌防治迫切需要解决的问题。目前的研究表明肿瘤微环境与膀胱癌的发生发展和预后密切相关，T细胞在其中发挥着重要作用。但目前的研究大多是基于T细胞亚群的变化和分子分型，研究膀胱癌B淋巴细胞重链的多样性。由于CDR3区是淋巴细胞识别抗原的主要部位，其长度及多样性都会影响它对抗原的识别与

3、亲和力，故其特异性可以认为是基因重组和体细胞高频突变的结果，CDR3序列多变的特征为抗原的选择提供一个多样化的细胞受体库。通过分析CDR3受体库，能为临床更好地监测和分析生理及病理状态下机体的免疫状况及免疫细胞的发生、发展机制提供新思路、新方法和手段，因此本研究中只对膀胱癌B淋巴细胞BCR的重链CDR3进行研究，更深层次的了解与肿瘤抗原结合的B细胞受体（Bcellreceptor,BCR）的序列信息和多样性变化。而免疫组库是研究B细胞受体重链、轻链，T细胞受体α、β、γ和δ链可变区的免疫系统多样性，可深入挖掘免疫组库与疾病的关系。第二代

4、高通量测序（High-throughputsequencing,HTS）是一种大规模并行的测序技术，与Sanger测序相比能在更低成本的基础上更快地得到高通量数据，一次可对几十万到几百万DNA分子进行序列测定，能够对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析。目的：探讨膀胱癌患者的B淋巴细胞免疫图谱的多样性，客观准确地评估膀胱癌的免疫状态，阐明膀胱癌的病因学及发病机制，为疾病诊断、治疗和预后监测提供新的理论依据。方法：收集5例手术切除新鲜冻存的膀胱癌组织（癌组织组）及其癌旁组织（对照组），I分别从各组织中提取全基因组DNA。通过设计各V

5、区家族和J区家族引物，扩增出BCR的所有CDR3区，再结合新一代高通量测序技术和平台，分析癌组织组和对照组中B细胞BCRH链CDR3区多样性、长度分布特征及各基因家族的表达频率等；比较CDR3氨基酸序列长度分布的正态性，V区、D区、J区和V-J组合区基因使用频率分布，个体TOP20V基因使用情况；从海量数据中筛选癌组织组和对照组中高度克隆性扩增的DNA序列（频率大于0.5%）、氨基酸序列（频率大于0.5%）、V-J组合（频率大于1%），及独有/共有DNA序列、氨基酸序列和V-J组合；此外，根据香农熵分析癌组织组与对照组中的BCR多样性差

6、异和克隆表达差异。揭示膀胱癌组织和癌旁组织中B淋巴细胞的免疫特性，阐明膀胱癌病理生理机制并寻找新的生物标志物、免疫治疗靶点。结果：1.长度分布频率：癌组织组中BCRH链CDR3氨基酸序列的长度分布频率最大的5个为17，16，19，15和11nt，对照组中最大5个为15，17，16，14和18nt；癌组织组和对照组的高斯分布拟合值分别为0.70和0.96。表明对照组的CDR3氨基酸序列长度分布比癌组织组更趋向于正态分布。2.克隆性扩增程度：与对照组相比，癌组织组B细胞高度克隆性扩增（频率大于0.5%）的DNA序列、氨基酸序列增加，且总体克

7、隆性扩增程度增加。3.BCR多样性：通过计算癌组织组的香农熵系数为0.39和对照组的香农熵系数为0.59，发现癌组织组的免疫组库多样性低于对照组。4.高度克隆性扩增（HEC）序列：统计分析后筛选发现癌组织组的高度扩增性克隆数为41个，高克隆比率为72%；对照组的高度扩增性克隆数为12个，高克隆比率为14%。结果表明无论在高度扩增性克隆数上，还是在高克隆比率上，癌组织组都是显著高于对照组。5.癌组织组和对照组间的IGHV、IGHD和IGHJ及V-J组合的表达频率存在明显差异。结论：1.与癌旁组织相比，膀胱癌组织内的B细胞克隆性扩增程度增加

8、，B细胞免疫组库多样性较低。2.免疫组库测序可以从DNA序列、氨基酸序列和V-J组合水平全面了解膀胱癌组织和癌旁组织BCRCDR3的多样性和特征谱，可以客观准确地评估膀胱癌免疫状II态，有助于深入认识膀胱癌