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1、CDR3导向抗体库法人源化抗膀胱癌Fab的鉴定【关键词】抗膀胱癌单克隆抗体噬菌体抗体库鼠单克隆抗体人源化 单克隆抗体(mAb)在许多领域得到极为广泛的应用,但由于其鼠源性,限制了在临床治疗方面的应用,近几年由于人源化和人源抗体研制技术的进展才得以迅速发展。目前,对鼠mAb进行人源化改造有多种方案。以噬菌体抗体库技术为基础的“抗原表位定向选择法”是近年来发展起来的一种鼠mAb人源化新方法［1,2］。该方法通过鼠-人轻重链可变区杂合配对,用抗原进行亲和筛选,最终得到与亲本鼠mAb识别相同抗原表位的人源抗体。该方法能够确保所筛选到的抗体为人源抗体,不含鼠源序列。但所获人源m
2、Ab的特异性及亲和力难以得到保证,有时所获人源抗体与抗原的结合活性会产生漂移,与亲本鼠mAb有所不同。CDR3导向抗体库法是在“抗原表位定向选择法”的基础上尝试的一种新方法。该方法通过构建含鼠mAbCDR3区基因的人源抗体库,并利用cre-loxp定位重组系统构建大容量抗体库,直接筛选与亲本鼠mAb特异性相同的人源抗体。运用该方法我们尝试人源化抗膀胱癌鼠mAbBDI,获得3株人源噬菌体抗体Fab基因,并证实筛选到的克隆与亲本鼠mAb识别相同的抗原表位［3］。本研究中,我们将对其特性作进一步分析鉴定。 1材料和方法 1.1材料抗膀胱癌噬菌体抗体由本室运用CDR3导向抗
3、体库法筛选获得,抗膀胱癌人-鼠嵌合抗体（cBDI）、抗乙肝表面抗原Fab(HBsAgFab)、大肠杆菌菌株、VCSM13、L929细胞由本室制备保存［4］;抗膀胱癌鼠mAb(BDI)、膀胱癌细胞株（EJ）由北京大学医学部泌尿研究所俞莉章教授提供;限制性内切酶为TaKaRa公司产品;各种酶标抗体购自Promega公司和Sigma公司。 1.2方法 1.2.1可溶性Fab抗体的表达及检测参照文献［5］介绍的方法构建和表达可溶性Fab抗体,并按照文献［6］介绍的方法接种膀胱癌EJ细胞及L929细胞于96孔板,以HRP-羊抗人Fab为二抗,检测上清中人Fab与膀胱癌细胞的结
4、合活性及特异性。 1.2.2相对亲和力的测定（1）测定硫氰酸铵(NH4S)对EJ细胞抗原的影响:接种EJ细胞于96孔板培养过夜,用2.5mL/L戊二醛或丙酮/无水乙醇（1∶1）固定细胞,30g/L的脱脂牛奶-PBS（MPBS）37℃封闭1h,加入不同浓度（0～2.0mol/L）的NH4S,室温静置15min,PBS洗3次,加入相同浓度的鼠mAb(BDI)和嵌合抗体（cBDI）,50μL/孔,37℃孵育1h,0.5mL/LTAbFab噬菌体上清50μL/孔,37℃孵育1h,0.5mL/LTin,PBS洗3次,加入HRP-抗M13（1∶5000）37℃孵育2h,再经洗涤后
5、OPD显色,A490计数。抗体与抗原结合的A490值在经洗脱后下降至50%的NH4S浓度即为该抗体的亲和指数,以mol/L表示［7］。 1.2.3免疫组化实验取临床病理确定的膀胱癌标本的石蜡切片脱蜡后,蒸馏水洗涤5min×3次,将切片放入盛有枸橼酸盐的缓冲液（pH6.0）的容器中,置微波炉内加热,在92℃～95℃之间持续10～15min,室温冷却10～20min。蒸馏水冲洗,PBS浸泡5min。50g/L山羊血清封闭1h,加入待测的抗体,4℃冰箱放置过夜。次日,PBS冲洗5min×3次,加HRP-抗M13或HRP-羊抗人Fab,室温放置2h,继续PBS冲洗5min×3
6、次,加入DAB显色,复染,封片。 2结果 2.1可溶性Fab抗体的表达及检测将获得的3株人源抗膀胱癌噬菌体抗体以NheI酶切,除去噬菌体抗体表达载体中的基因Ⅲ片段,得到可溶性Fab段的表达质粒,用其转化大肠杆菌XL1-Blue,经阿拉伯糖诱导制备可溶性Fab上清,用HRP-羊抗人Fab进行ELISA检测,证明该Fab段能特异地与EJ细胞结合（表1）。 图1硫氰酸铵对固相化EJ细胞抗原的影响（略） 在此基础上现用该方法比较了所获人源与鼠源BDI噬菌体抗体的相对亲和力,表明经过CDR3引导所获得的人源抗体阳性克隆中,其中的2个克隆的亲和指数比较低,均为0.25mol
7、/L,1个克隆的亲和指为0.7mol/L,接近于鼠源的亲和指数（0.9mol/L）的水平（图2）。 图2抗体相对亲和力的测定（略） 2.3肿瘤组织免疫组化实验为进一步确定所筛选的人源抗体的特异性,现又用确诊的膀胱癌组织的石蜡切片进行了免疫组化实验,其所筛选到的人源抗膀胱癌抗体能够与膀胱癌组织特异结合（图3）。 图3免疫组化鉴定人源抗膀胱癌抗体Fab（SP,×100）（略） A:正常组织;B:膀胱癌组织. 3讨论 BDI是一株对膀胱癌细胞具有高特异、高亲和性的抗膀胱癌mAb,在放射免疫诊断和治疗试用中取得良好的效果。为使其更好的
