高强度超声对乳清蛋白的结构及功能特性影响研究

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1、中文摘要高强度超声对乳清蛋白的结构及功能特性影响研究本研究隶属于中国科技部十二五项目-《乳清蛋白的应用技术研究与应用》（2013BAD18B07）。乳清蛋白是一种存在于乳中具有营养丰富、高生物效价的优质天然蛋白。β-乳球蛋白是乳清蛋白的主要组成成分，氨基酸比例佳，支链氨基酸高，在分子水平上具有独特的空间分子构象和理化性质，因此β-乳球蛋白在食品工业中具有特殊的应用价值。超声波是一种新型的冷处理改性技术，具有穿透力强、方向性好、能量大等特点，近年来已有研究发现高强度超声技术能够改善蛋白质的功能特性。为进一步

2、拓展乳清蛋白在食品领域中的应用，本文主要通过高强度超声技术改性β-乳球蛋白及其酶解产物以及乳清蛋白纳米粒子。主要内容包括以下几个方面：（1）高强度超声对β-乳球蛋白理化特性的影响及超声改性条件优化；（2）高强度超声对β-乳球蛋白及其酶解产物结构影响；（3）高强度超声β-乳球蛋白及其酶解产物的抗氧化活性及抑制Caco-2细胞氧化应激机制研究；（4）高强度超声对β-乳球蛋白及其酶解产物诱导小鼠巨噬细胞免疫功能的影响；（5）高强度超声对乳清蛋白-桃柁酚纳米粒子物理特性及抑菌机制的影响。（1）经高效液相色谱法测定

3、分离纯化的β-乳球蛋白纯度约为91%。经oBox-Behnken试验设计优化得到β-乳球蛋白最佳超声工艺参数为超声温度45C、超声时间20min、超声振幅30%。在此条件下β-乳球蛋白的表面疏水性、游离巯基含量分别为5812.08和5.97μmol/g。高强度超声增加了β-乳球蛋白的平均粒径（1.21±0.05到1.66±0.03nm）和zeta电位绝对值(15.47±1.60到27.63±3.30)，同时使粒径分布变宽（0.44±0.23到0.67±0.32）。高强度超声提高了β-乳球蛋白α-螺旋含量（

4、16.9±0.16到35.1±0.09%）和β-折叠含量（38.0±0.09到59.2±0.01%），降低了无规则卷曲含量（28.2±0.63到1.4±0.07%）。说明高强度超声使β-乳球蛋白结构变得伸展，空间结构发生明显变化。高强度超声提高了β-乳球蛋白的变性程度（0.59±0.038到0.83±0.17J/g），降低了β-乳球蛋白的变性温o度（71.08±2.78到58.13±2.29C），说明高强度超声降低了β-乳球蛋白的热稳定性。但高强度超声对β-乳球蛋白的分子量分布影响不显著。I（2）高强度超

5、声对β-乳球蛋白的分子量分布影响不显著，但明显改变了β-乳球蛋白酶解产物的分子量分布。高强度超声对β-乳球蛋白酶解产物的高效液相色谱洗脱峰有明显影响，在13min，18min，35min和37min出现洗脱峰，而β-乳球蛋白本身的洗脱峰逐渐减小，说明高强度超声能够提高β-乳球蛋白的酶解程度。高强度超声提高了β-乳球蛋白及其酶解产物的α-螺旋含量（16.9±0.16到35.1±0.14%）和β-折叠含量（33.3±0.2到59.2±0.14%）。高强度超声增强了β-乳球蛋白及其酶解产物的荧光强度，β-乳球蛋

6、白酶解产物的最大吸收波长发生红移，表明β-乳球蛋白的结构展开、含有荧光发色团的氨基酸进入蛋白质疏水区域发生相互作用。高强度超声降低了β-乳球蛋白及其酶解产物的紫外吸收强度，其最大吸收波长发生蓝移，表明β-乳球蛋白分子的表面区域发生了构象变化，在超声和酶解的作用下β-乳球蛋白分裂和沉淀行为优于生色基团的暴露，同时生色基团由于β-乳球蛋白结构的变化被包埋于分子内部。（3）高强度超声能够有效改善β-乳球蛋白及其酶解产物的抗氧化能力。化学+抗氧化活性评价指标表明：高强度超声提高了β-乳球蛋白及其酶解产物的ABTS

7、自由基的清除活性（30.60±0.13到90.58±0.13%）、DPPH自由基的清除活性（24.27±3.20到82.17±0.38%）和氧自由基吸收能力（2.92到40.30TE/μM）。细胞抗氧化活性评价指标表明：高强度超声提高了β-乳球蛋白及其酶解产物对ROS的抑制作用，显著提高了β-乳球蛋白酶解产物抑制DCFH氧化能力（EC50值从780.03±3.72到360.03±3.13μg/mL）。高强度超声β-乳球蛋白及其酶解产物降低了细胞MDA水平（136.60±2.31到82.38±0.58nmo

8、l/mgprot），提高了细胞SOD（53.14±0.12到64.16±0.14U/mgprot）、CAT（54.43±0.15到70.36±0.18U/mgprot）和GSH-Px（54.56±0.45到88.49±0.59U/mgprot）等抗氧化酶活性。这主要是由于高强度超声过程中产生的空化作用，使β-乳球蛋白结构展开，内部活性部位暴露出来，促进酶解反应更易发生，同时促进了酶解产物对自由基的清除效果。高强度超声β-乳球蛋