七鳃鳗PHB2增强细胞氧化应激耐受性的机制研究

《七鳃鳗PHB2增强细胞氧化应激耐受性的机制研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、分类号：学校代码：10165密级：学号：201511000880硕士学位论文七鳃鳗PHB2增强细胞氧化应激耐受性的机制研究作者姓名：时颖学科、专业：海洋生物学研究方向：海洋生物功能基因与蛋白质组学导师姓名：李铁松2018年5月摘要七鳃鳗作为地球上最原始的无颌类脊椎动物之一，被认为是现有的无颌类脊椎动物中最理想的模式生物，是连接无脊椎动物和脊椎动物的重要桥梁。抗增殖蛋白（PHB）是一种广泛分布于多种生物细胞中且高度保守的蛋白。PHB蛋白家族包含两个成员（PHB1和PHB2），两个成员之间高度同源。PH

2、B2蛋白由三部分组成，分别是：一个亲水的跨膜α螺旋的N端(位于N端的LXXLL序列，可与雌激素受体相结合)，一段保守的PHB区（对蛋白间相互作用和脂筏的相互联系起重要作用）和用于与PHBl形成复合体的C端。人类PHB蛋白家族的PHB1包含7个外显子，由275个氨基酸组成，编码32kDa的蛋白；PHB2蛋白包含10个外显子，由316个氨基酸组成，编码33.3kDa的蛋白。PHB1和PHB2蛋白形成异源二聚体，12-16对这样的异源二聚体聚合形成直径为20-25nm的花环栅栏状的复合物，锚定在线粒体内膜

3、，维持线粒体结构和功能的稳定。活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)是细胞代谢过程中所产生的活性氧簇，常见的-有超氧自由基（02）、过氧化氢（H2O2）和羟自由基（-OH）等。适量的ROS对细胞的生命活动有益，有助于促进细胞的增殖和分化，然而过量爆发的ROS能对细胞内的脂类、蛋白质和DNA造成氧化损伤。与正常细胞相比，肿瘤细胞大多处于高氧化应激状态，其对ROS浓度的升高更敏感。此外，ROS还可激活下游信号通路（如MAPK通路）诱导细胞发生早期凋亡。长期处于氧化应激状态可引发机体

4、患有帕金森、心脏病及阿尔兹海默症等相关疾病。本研究在课题组前期工作基础之上，通过激光共聚焦显微镜进一步观察了七鳃鳗PHB2蛋白（rLm-PHB2）在人胚肾上皮细胞（293T）和张氏肝细胞（CHL）中的定位表达情况，结果显示，正常情况下Lm-PHB2主要定位于细胞核中，而当细胞受到过氧化氢刺激后，Lm-PHB2会由细胞核迁移至线粒体中。为了探究氧化应激条件下Lm-PHB2定位迁移的机制，构建了rLm-PHB2氨基酸序列的截短突变体和氨基酸突变体（Lm-PHB2AAA1-50aa,Lm-PHB251-2

5、00aa，Lm-PHB2201-299aa和Lm-PHB21-57aa），通过激光共聚焦显微镜观察各截短突变体和氨基酸突变体的表达和定位情况，结果显示，只有截短突变体Lm-PHB21-50aa能够靶向性定位于线粒体，这表明Lm-PHB2定位迁移至线粒体是由蛋白N端序列决定的，且第17、48和54位氨基酸是决定其定位迁移的关键氨基酸。利用Ni柱纯化法提取重组七鳃鳗PHB2可溶性蛋白，用rLm-PHB2蛋白孵育293T细胞后给予过氧化氢刺激，通过流式细胞术的方法检测rLm-PHB2蛋白对细胞中ROS产生

6、的影响，结果显示，rLm-PHB2蛋白可以显著抑制由过氧化氢诱导的ROS的爆发，进而增加293T细胞氧化应激耐受性。为了进一步探究Lm-PHB2增强细胞氧化应激耐受性机制，利用激光共聚焦荧光显微镜分别观察Lm-PHB2对于过氧化氢刺激后293T细胞的线粒体形态和线粒体膜电位的变化情况，结果表明，Lm-PHB2参与维持线粒体形态及线粒体膜电位的稳定。为探究Lm-PHB2参与维持线粒体形态功能稳定的机制，采用Q-PCR和Westernblot的方法检测Lm-PHB2对过氧化氢刺激前后293T细胞中OPA

7、1表达量的影响，结果显示，转染pEGFP-N1-Lm-PHB2质粒的293T细胞经过氧化氢刺激后OPA1在mRNA和蛋白水平的表达量均显著增加。以上结果表明，Lm-PHB2通过与OPA1蛋白相互作用进而参与维持线粒体形态功能稳定。于是利用免疫荧光和免疫共沉淀的方法检测二者的相互作用的情况，结果显示，当293T细胞受到过氧化氢刺激后OPA1与Lm-PHB2能够相互作用。为探究Lm-PHB2是否影响过氧化氢刺激诱导的细胞凋亡，分别利用Q-PCR和Westernblot的方法检测pEGFP-N1-Lm-P

8、HB2质粒转染293T细胞前后，给予细胞过氧化氢刺激与否对细胞中HAX1表达量的影响，结果一致表明pEGFP-N1-Lm-PHB2质粒转染细胞后给予过氧化氢刺激HAX1在mRNA和蛋白水平的表达量均显著增加。同时，免疫荧光和免疫共沉淀的结果均表明Lm-PHB2与HAX1通过相互作用进而来抵制由过氧化氢诱导的细胞凋亡。综上所述，本文在实验室前期工作基础之上，初步揭示了氧化应激条件下Lm-PHB2在293T细胞和CHL细胞中定位迁移的分子机制，即Lm-PHB2在氧化应激条