CREB在线粒体氧化应激导致颞叶癫痫认知功能障碍中的作用研究

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1、ＣＲＥＢ在线粒体氧化应激导致颞叶癲痫认知功能障碍中的作用研究ＥｆｆｅｃｔｏｆＣＲＥＢｏｎｔｅｍｐｏｒａｌｌｏｂｅｅｐｉｌｅｐｓｙｃｏｎｉｔｉｖｅｉｍａｉｒｍｅｎｔｇｐｍｅｄｉａｔｅｄｂｙｔｈｅｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓｏｆｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ作者姓名：孙立超专业名称：神经病学研究方向：癫痫的基础与临床研究指导教师：林卫红教授学位类别：医学博士培养单位一医院：白求恩第＾＾＾”论文答辩日期：年月日授予学位日期：年月日答辩委员会组成：姓名职称

2、工作单位主席杜玉君教授吉林大学第一医院委员姚丽芬教授哈尔滨医科大学王东岩教授黑龙江中医药大学刘亢丁教授吉林大学第一医院金涛教授吉林大学第一医院未经本论文作者的书面授权，依法收存和保管本论文书面版本、电子版本的任何单位和个人，均不得对本论文的全部或部分内容进行任何形式的复制、修改、发行、出租、改编等有碍作者著作权的商业性使用（但纯学术性使用不在此限）。否则，应承担侵权的法律责任。吉林大学博士学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交学位论文，是本人在指导教师的

3、指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中己经注明引用的内容外，本论文不包品出含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作成果。对本文的研究做。明重要贡献，中以确方式标本人完全意识到本的个人和集体均己在文明声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签：名４：年＂日日期月中文摘要CREB在线粒体氧化应激导致颞叶癫痫认知功能障碍中的作用研究背景：癫痫患者易合并其他精神或神经疾病称为癫痫共患病。癫痫共患病在癫痫患者中十分常见，30~50%的癫痫患者可受累。现代癫痫病的治疗不仅局限于痫性发作的控制，近年来癫痫共

4、患病的治疗与预防已成为癫痫领域的关注热点。颞叶癫痫（temporallobeepilepsy，TLE）起源于海马、海马旁回、杏仁核以及外侧颞叶新皮质，是临床最常见的癫痫综合征。海马硬化是TLE最常见的病因及病理改变。认知功能障碍是TLE常见癫痫共患病，严重影响患者的生活质量，具体机制不清。研究表明环腺苷酸反应元件结合蛋白（cAMPresponseelementbindingprotein，CREB）活化的神经元优先参加记忆形成。氧化应激及线粒体功能损伤被认为是许多退行性神经系统疾病的主要发病机制，如阿尔茨海默病、帕金森病、血

5、管性痴呆等。本研究试图揭示CREB在线粒体氧化应激导致TLE认知功能障碍中的作用。目的：探讨CREB在线粒体氧化应激中的作用以及CREB在线粒体氧化应激导致TLE认知功能障碍中的作用机制，为寻找TLE认知功能障碍新的治疗靶点提供思路和方向。方法：（1）细胞水平：分离出生24h的C57乳鼠海马神经元行原代培养，应用免疫荧光对海马神经元进行鉴定。将构建的CREB表达空载、干扰空载、表达载体及干扰载体转染至培养的神经元。细胞实验分为六组：空白对照组、转染CREB表达空载组、转染CREB干扰空载组、转染CREB表达载体组、转染CRE

6、B干扰载体组与MitoQ组。ELISA检测各组神经元SOD及MDA的水平。Westernblot检测PKA、CaMKIV、CREB、pCREB、arc及c-fos蛋白表达。qRT-PCR检测CaMKIV、CREB、arc、c-fosmRNA表达。线粒体I膜电位检测神经元凋亡率。流式细胞术检测神经元活性氧簇（reactiveoxygenspecies，ROS）水平。（2）动物水平构建匹罗卡品诱导的小鼠TLE模型。动物实验分为五组：空白对照组、假处理组、模型+生理盐水组、模型+CREB基因抑制剂666-15组、模型+MitoQ组

7、。各组小鼠均行水迷宫行为学实验。ELISA检测CA1SOD及MDA的水平。免疫组化检测CA1CaMKIV、CREB、arc、c-fos、PKA、pCREB组织蛋白表达。Westernblot检测CA1PKA、CaMKIV、CREB、pCREB、arc及c-fos蛋白表达。qRT-PCR检测CA1CaMKIV、CREB、arc、c-fosmRNA表达。线粒体膜电位检测CA1神经元凋亡率。结果：成功分离、原代培养并鉴定海马神经元，并成功构建CREB表达载体和干扰载体。ELISA显示表达载体组SOD水平与对照组无差异，干扰载体组S

8、OD水平低于对照组及表达载体组（P<0.05）。MDA水平表达载体组低于对照组（P<0.05），干扰载体组高于对照组（P<0.05）。Westernblot显示CREB干扰载体能够抑制PKA、CaMKIV、CREB、pCREB、arc及c-fos的蛋白表达。qRT-PCR显示CREB干扰载