《质粒的提取与纯化》PPT课件

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1、实验一质粒的提取(碱法)实验目的实验原理实验仪器、材料与试剂实验步骤实验结果及讨论实验目的了解碱法提取质粒的原理；掌握碱法提取质粒的方法。实验原理质粒是一种细菌染色体外的、具有自主复制能力的、共价闭合环状超螺旋结构的小型DNA分子。碱裂解法提取质粒是实验室常用的方法。这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。结构的三大要素：多克隆位点选择标记（耐药性，LacZ）独立的复制单位种类：质粒噬菌体酵母人工染色体（YAC）反转录病毒载体表达载体等pBCSKmapT-载体在碱性条件（p

2、H12.5）下，线性染色体DNA的双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的氢键虽然断裂但两条互补链彼此缠绕，紧密结合在一起。当加入乙酸钾恢复至中性时，染色体DNA分子难以复性，而质粒DNA分子很快复性，离心时染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中。用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到较纯的质粒DNA。实验仪器、材料与试剂（一）仪器1.恒温摇床2.超净工作台3.高压灭菌锅4.高速台式离心机5.微量取液器（二）材料含pBCKS质粒的大肠杆菌DH5α。含重组质粒的大肠杆菌DH5α。（三）试剂1.LB液体培

3、养基（1L）胰蛋白胨10g酵母提取物5gNaCl10g加去离子水至800ml搅拌，使溶质完全溶解，用NaOH调节pH值至7.0，加入去离子水至总体积为1升，高压蒸汽灭菌20分钟。LB固体培养基（1L）在上述LB液体培养基（1L）中加入琼脂粉15g。2.SolutionⅠ50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris.·Cl(pH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0)高压灭菌后，4℃保存备用。3.SolutionⅡ(现用现配制)0.2mol/LNaOH1%SDS4.SolutionⅢ（100ml）5mol/L

4、KAc60ml冰醋酸11.5ml水28.5ml配制成的溶液Ⅲ含3mol/L钾盐、5mol/L醋酸（pH4.8）。5.氨苄青霉素（Amp）用无菌水配制成100mg/ml溶液，置-20℃冰箱保存备用。6.胰RNA酶将胰RNA酶（RNA酶A）溶于10mmol/LTris.Cl(pH7.5)、15mmol/LNaCl中，配成10mg/ml的浓度，于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。7.氯仿，乙醇，70%乙醇。实验步骤质粒的提取1.用灭菌的牙签挑取单菌落放入50mlLB液体培养基（含Amp0.1

5、mg/ml）中，37℃振荡培养过夜。2.将菌液倒入1.5mlEppendorf管中，10,000rpm离心1min，去掉上清液，重复两次。沉淀悬于200μLSolutionI中,涡旋使充分悬浮。3.加入300μLSolutionII，混匀（注意动作轻），冰箱3℃放置5min。4.加入300μLSolutionIII,混匀（注意动作轻），冰箱3℃放置5min。5.12,000rpm，离心5min，将上清移至1个新Eppendorf管中，注意所取体积（约600μL）。6.加入等体积氯仿（约600μL），混匀（注意动作轻

6、）。12,000rpm，4℃，离心10min，取上清液。7.上清液中加入预冷的等体积异丙醇，-20℃沉淀20~30min。8.12,000rpm离心15min。9.去上清，沉淀加入500μL70%乙醇洗涤2次（12,000rpm离心3分钟）。10.去掉上清（注意沉淀勿丢失），室温或真空干燥沉淀。11.每管中加入25μL无菌水1μLRNase，37℃溶解质粒DNA。Biospin质粒DNA小量提取试剂盒（实际用）操作过程1.将1～1.5ml过夜培养的细菌菌液加入1.5ml离心管中。2.于10，000rpm离心30秒，

7、并弃去上清液。如有需要，可多次重复步骤1、2，以收集更多细菌菌体。但勿过量，以免影响提取质粒的质量。3.加250μlResuspensionBuffer，重悬细菌体沉淀。重悬后应该没有细菌团块。4.加250μl细胞LysisBuffer，轻柔颠倒4～6次。不要剧烈振动，以防止基因组DNA被剪切。注意不要让反应持续超过5分钟。5.加350μlNeutralizationBuffer，立即轻柔颠倒离心管4～6次。溶液应该出现絮状物，但不会出现局部沉淀。6.于13,000rpm离心10分钟。如离心机转速不够可延长离心时间

8、，直至形成紧密的白色沉淀。7.将步骤6离心后得到的上清液转移到Spincolumn内。于6,000rpm离心1分钟，并弃去接液管内液体。8.向Spincolumn内加650μlWashBuffer，于12，000g离心30～60秒，并弃去接液管内液体。9.重复第8步一次。10.再次于12，000rpm离心1分钟，然后将Spincolumn转移到无菌的1.5m