《蛋白诱导LJ》PPT课件

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1、实验四基因的诱导表达与融合蛋白的纯化实验目的掌握基因诱导表达的原理与方法掌握蛋白质纯化的基本原理巩固蛋白质电泳的基本方法基因工程的下游技术基因的诱导表达和重组蛋白的纯化一、基因表达系统表达载体(含有表达元件)IPTG诱导启动子载体(tac/trc/lac-pUC,pTZ,pSK,pBluescript,pGEM)表达宿主T7噬菌体启动子载体(不依赖大肠杆菌RNAP,T7-lac)PL启动子载体(温度敏感)原核(大肠杆菌-物美价廉、枯草芽孢杆菌)真核（酿酒酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞）二、表达瓶颈1、蛋白翻译后折叠、修饰

2、；2、蛋白翻译后易降解、形成包涵体；3、蛋白分离纯化、复性；4、基因表达调控。三、表达方式融合蛋白1、基因融合：将两个或多个开放阅读框架按一定顺序连接在一起，表达产物是一个杂和蛋白，靶蛋白连接在运载蛋白（识别标签）的氨基端或羧基端。2、应用潜力：简化靶蛋白的标记与分离；靶蛋白与信号肽连接，将靶蛋白分泌到特定细胞区；保护靶蛋白免受宿主蛋白酶降解；改善靶蛋白溶解性，防止形成包含体。识别标签β-半乳糖苷酶（lac-Z）谷胱甘肽-S-转移酶（GST）多聚组氨酸（poly-his）人工7肽FLAG人工标签选择表达载体常用的关键元

3、件：启动子和调节序列（表达强弱、细胞或组织特异性、表达调节等，如本实验的乳糖操纵子。）融合基因（纯化、标签，或增强蛋白可溶性等。如GST融合蛋白用GST柱亲和层析;多聚His标签－6×His，便于镍柱亲和层析纯化。）分泌信号筛选标记其它纯化条件宽松由于螯合作用不受变性剂等因素的影响，故可在SDS或尿素等存在的条件下进行纯化，这对一些溶解度不佳的重组蛋白的纯化尤其有利。四、表达体系选择常用体系—大肠杆菌体系（菌株+载体）依据：蛋白大小（<100aminoacidresidue）蛋白数量蛋白活性要求（产生抗体、生物学研究、

4、结构研究）主要表达小的细胞因子和生长因子五、实验流程：细菌亲和层析IPTG诱导细菌总蛋白重组蛋白融合蛋白乳糖操纵子的特性SDS-PAGE初步分析六、实验原理重组蛋白的表达方式与纯化方式是由表达载体决定的。在原核表达系统，表达载体均携带一个条件表达的启动子，由这一启动子控制外源基因的表达。在未经诱导的情况下，外源基因不表达，这就防止了外源基因产物对细菌正常生长的干扰。在细菌生长达到一定数量时再加入诱导剂诱导基因表达，可最大限度提高重组蛋白的产量。重组蛋白的表达与诱导剂加入的时间和浓度相关。七、本实验表达载体pGEX系统含

5、有启动子(tac)及Lac操纵基因、SD序列、LacI阻遏蛋白基因等调控序列。SD序列下游就是GST基因，使克隆的外源基因与GST基因相连。表达产物为谷胱苷肽-S-转移酶和外源蛋白的融合体。优点：①可诱导高效表达；②表达的融合蛋白质纯化方便；③使用凝血酶和Xa因子就可从表达的融合蛋白中切下所需要的蛋白质和多肽。表达产物:GST-目的蛋白Thestructureoflacoperon调节序列结构基因I阻遏因子Repressorandnegativeregulation异半乳糖异丙基硫代半乳糖苷异半乳糖本实验采用的pGEX

6、4T-1表达载体，外源基因与GST形成GST-融合蛋白。由于GST能特异性结合谷胱甘肽，因此在纯化时可利用偶联谷胱甘肽的琼脂糖凝胶进行亲和层析，纯化过程简便且产物纯度高。八、影响外源蛋白表达的主要因素细胞生长速率细胞生长温度（20-37℃）诱导剂浓度和诱导时间①首先进行小规模预实验确定最佳条件②大规模培养进行提取、纯化目的蛋白九、操作步骤（一）融合蛋白的诱导表达1．接种2个单菌落（转化了空质粒pGEX-4T-1的BL21菌种及携带112的菌种）于5mlLBAmp+液体培养基，37℃振荡培养过夜。2．将500µl过夜培养

7、物与50mlAmp+LB混合，37℃振荡培养4小时。——放大培养3．将培养物分成8管，每管5ml，按下表所示加入IPTG，30℃振荡培养4小时。序号加入的100mMIPTG的体积（ul）IPTG终浓度（mM）诱导时间（小时）1（空质粒）--42（112）--43（空质粒）250.544（112）50.145（112）250.546（112）501.047（112）1002.048（112）2505.044.每管菌液3000rpm离心5分钟，收集沉淀，弃上清。5.每管各加入200μl的上样缓冲液，振荡煮沸变性5分钟备用。

8、聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺(methylene-bisacrylamide,简称Bis)在加速剂和催化剂的作用下聚合并联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophor