伞滑刃线虫属和外滑刃线虫属部分种群的分类及分子鉴定研究

《伞滑刃线虫属和外滑刃线虫属部分种群的分类及分子鉴定研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、Y9050’78洳江≥、暗博士学位论文伞滑刃线虫属和外滑刃线虫属部分种群的分类及分子鉴定研究作者姓名盘皇茎指导教师．塑丝惑盔堂学科(专业)蕉堑病墨堂所在学院壅些鱼生堑垫盔鲎睦中国·杭州浙江大学博士学位论文中文摘要伞滑刃线虫属(B“W印^膪n幽W)中松材线虫(B掣卸矧“s)是松树癌症一松树萎蔫病的病原物。由于其危害严重和防治困难受到世界各国的高度重视，很多国家将其列为检疫对象。鉴于该线虫的重要性以及在分离该线虫的过程中，常分离到该线虫所在属的其它线虫，本研究对松材线虫及其所在属的伞滑刃线虫进行了系统的形态学和分子分类与鉴定研究，探索了利用rDlqA的PcR．

2、RFLP、duplex_PcR以及制各松材线虫单克隆抗体等方法构建部分伞滑刃线虫的分类诊断系统；同时对伴随松材线虫分离到的两种外滑刃线虫属种群(松外滑刃线虫和华美外滑刃线虫)进行了形态学与分子鉴定。本研究对17个伞惰刃线虫群体进行形态学系统性比较，初步鉴定出8个松材线虫群体和6个拟松材线虫群体，2个明显区分于两者的伞滑刃线虫属种。应用rDNA中ITs的PcR．RFLP分析对形态学特征极其相似的来自中国、日本和韩国的松树或木质包装箱中分离出来的伞滑刃线虫属6个群体进行了分子鉴别。其中来自浙江镇海的松树和日本的木质包装箱中分离出的各一线虫群体被鉴定为松材线虫，

3、而来自浙江富阳的松树和韩国、香港及日本的木质包装箱中的另一群体等4个群体被鉴定为拟松材线虫。本研究中选用的4种限制性内切酶(胁矿I、fkPIII、埘印I、c加I)的特异性酶切位点均可以有效地鉴别松材线虫和拟松材线虫。同时对来自中国浙江病死木和中国香港木质包装箱的两种伞滑刃线虫进行了形态与rDNA'PcR—RFLP的分析，结果显示来自浙江的伞滑刃属线虫为BM加“8，而来自香港的则为B廊口ik，砌e，两者均为在中国首次报道。此外运用clustalxl8、Mega2软件对所获得的上述四种伞滑刃线虫ITs序列以及从GellBank上下载的部分伞滑刃属线虫序列进行比

4、对，并利用uPGMA法构建部分伞滑刃线虫系统树，12种伞滑刃线虫形成3个组群，反映了伞滑刃线虫属内种间的遗传学关系。根据松材线虫及从GeI】Bank上下载的其他伞滑刃线虫ITs序列，运用DNAstar软件进行比对分析，依据其在ITsl与ITs2上的差异，设计了松材线虫种的特异性引物。经检测，松材线虫种内群体能特异性扩增出长约580bp的片段，而拟松材线虫则为阴性，酶切与序列测定结果显示与ITs区序列相关部分完全吻合。将用于扩增28sRNA基因D2D3区的通用引物与特异性引物一起进行dupIex．PcR扩增，结果所有的松材线虫株系均产生两大小分别约为770b

5、p和580bp的片段；而其他线虫类群只能产生770bp左右的单一片段，无松材线虫种特异性片段。Duplex，PcR可对松材线虫进行种特异性检测，与其它的PcR方法相比，该方法具有灵敏、快速、有效等特点。在对rDNA中ITs比较的基础上，该研究还探讨了28sRNA基因在分类和鉴定中的作用。通过对浙江大学博士学位论文部分伞滑刃线虫28sRNA基因中的D2D3区的PcR扩增表明：扩增的PcR片段大小无明显差异。选用限制性内切酶对扩增的片段进行酶切，结果显示：除松材线虫与拟松材线虫的酶切图谱比较接近外，其他线虫如四，口加“圻、口曲“f砌?出P、B如洲拘酶切图谱差异

6、较大，因此可利用限制性内切酶构建酶切图谱以相互区别。在松材线虫与拟松材线虫的酶切图谱中发现，髓自』236I能将两者区分开，结合该内切酶对其它线虫的酶切图谱，发现其对28sRNA基因D2D3区的酶切可用于鉴定伞滑刃线虫属的不同种群。此外对本研究中的四种伞滑刃线虫，结合从GeneBank上下载的部分伞滑刃线虫的28sRNA基因D2D3区序列构建伞滑刃线虫种群的系统树，构成的聚类组群与ITs区聚类分析结果基本一致。此外本研究还系统的探索了利用单克隆抗体对松材线虫特异性鉴定。利用松材线虫匀浆液免疫BALB／c小鼠，取其脾细胞与sP2，o骨髓瘤细胞融合获得一株能稳定

7、传代并分泌针对松材线虫单克隆抗体(Mab)的杂交瘤细胞，命名为1D3，经ELIsA检测其特异性好、效价达到5．12×105，抗体类型为IgGl亚类。westem_blot分析表明，1D3单克隆抗体株与松材线虫匀浆液有明显反应。这为正确鉴别松材线虫与拟松材线虫又提供了一快速、灵敏有效的诊断方法。这是国际上首次获得松材线虫单克隆抗体。在形态学比较及鉴定的基础上，首次报道了外滑刃线虫属两种群的rDNA的特征。通过对ITs和28sRNA基因中D2D3区的PcR扩增和序列分析，两者PCR扩增片段大小各异，酶切图谱差异明显，说明同属的这两种线虫在分子水平存在较明显的差

8、异，这与其形态上存在相当差异的结果相吻合。因此不仅可利用ITs．P