鸡堆型艾美耳球虫DNA疫苗的研究

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1、中文摘要近lO多年来，鸡球虫病的免疫预防研究越来越受到人们的重视。寻找免疫原性好的保护性抗原，是完成基困■程苗和核酸疫苗研究的前提。微管是球虫的一种重要的细胞器，在球虫入侵宿主细胞的过程中起着重要作用，本论文以E．acervulina的微管蛋白为研究对象，进行了如下试验：1．E．acervulinaⅡ一微管蛋白基因的克隆以EacervulinaBj株孢子化卵囊总KNA为模板进行RT-PCR，按照Genebank上发表的a一微管蛋白基因的序列(YamageM，1995)设计引物，上、下游引物分别加上BamHI和EcoRI的酶切位点，扩

2、增的PCR产物与pGEM—T载体连接后转化至JIll09感受态细胞，蓝白斑筛选，将PCR和酶切鉴定正确的阳性质粒进行测序。结果表明．扩增产物大小为1955bp，与YamageM(1995)在Genebank上登录的a一微管蛋白基因的同源性为97．4％。此基因现已作为￡acervulinaBJ株的a一微管蛋白基因登录到Genebank上，登录号是AY488134。2．a一微管蛋白基因的表达及鉴定重新设计表达引物，以阳性质粒为模板，克隆a一微管蛋白基因的阅读框．与pGEX一6P-1载体连接后转化至E．coflBL21(DE3)表达菌，用

3、1．0ramIPTG诱导。SDS-PAGE电泳后发现在诱导后2h蛋白表达量即达到较高的水平，5h达到高峰，表达蛋白的分子量为69kDa，波层扫描分析表达蛋白占菌体蛋白的33％。用GST抗体进行Western．blot检测，成功检测到特异性条带。3．口一微管蛋白真核表达载体(p一Ⅱ一tubulin)的构建将微管蛋白基因的ORF片段插入到真核表达载体pcDNA3．1中，构建成核酸疫苗pcDNA3．1一a—tubulin(p-a-tubulin)，经酶切和PcR鉴定为正确插入。4．o一微管蛋白亚单位疫苗和核酸疫苗的免疫保护效果研究核酸疫苗

4、和亚单位疫苗分别设高(10011g)、中(50ug)、低(25ug)三个剂量组，同时设地克珠利药物组、活卵囊组、红对照组和空白对照组，在鸡只7日龄和14日龄分别进行免疫。一周后用12×101个￡acervulinaBJ株孢子化卵囊进行攻虫，结果表明。一微管蛋白核酸疫苗中剂量(50ug)免疫时，则可使点acervulina攻虫鸡的卵囊产量下降34．38％，肠道病变记分降低33．33N，同时鸡只增重效果明显，相对增重率为82．84％，ACI值为164，备指标优于核酸疫苗高剂量和低剂量免疫组。而亚单位疫曲各剂量组对Eacervulina攻

5、虫鸡的效果低于核酸疫苗组。关键词：堆型艾美耳球虫，a．微管蛋白．弧单位疫苗，DNA疫苗AbstractTheresearchtoimmunizitionoftheCoccidianwasgivenmoreandmoreattentioninrecent10years．FoundingtheantigensthathavebetterimmunityisthepreconditiontogiveresearchontheirsrecombinantvaccineandDNAvaccine．Tubulinisoneoftheimport

6、antorganellesofcoceidia,whichplaysanimportantroleduringinvadingintothecellsofhost．Wefocusontheresearchofu-tubulinanddidthetestsasfoIlows：I．CloneoftheE．acervulina口·tubulingeneThetotalRNAofthesporulatedoocystsofE．acervulinaBJstrainwasextractedandusedasthetemplateforRT-PC

7、R．TheprimersWeredesignedaccordingtothepublishedn—tubulinsequenceonGenebank(YamageM，1995)．nle8amHIandEcoRIenzymecleavagesiteswereaddedrespectivelyontheupperandlowerpdmer．TheamplifiedPCRproductwaslinkedwiththepGEM-Tvector,andthentransfofnledintotheJMl09competentcell，scre

8、enedthrogIghtheblueandwhitespot,identifiedbyPCRandcleavedwithendonilcle；9,ses,andthenthepositiveclonewassequenced．The