鸡il-18堆型艾美耳球虫3-1e-α-tubulin增强型核酸疫苗免疫保护机理

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1、东北农业大学博士学位论文鸡IL--18堆型艾美耳球虫3--1E--α--tubulin增强型核酸疫苗免疫保护机理姓名：黄小丹申请学位级别：博士专业：基础兽医学指导教师：李广兴2012-06-10摘要鸡球虫病是由几种艾美耳球虫引起的一种肠道性疾病，是影响家禽生产性能、降低经济效益的重要寄生虫性疾病。实践证明，应用刺激宿主机体产生广泛的免疫反应来预防和治疗鸡球虫病是更有效的方法之一。核酸疫苗的显著优势是刺激机体产生广泛的细胞免疫和体液免疫应答及持久的免疫记忆，尤其是结合一定数量的细胞因子制成协同的核酸疫苗，更具有诱人的前景。基于此我们选

2、择两种球虫主要抗原基因进行连接构建成融合基因，插入到真核表达载体中并和特定的细胞因子组成增强型核酸疫苗，检测鸡抗球虫攻击的免疫保护作用。本研究选择禽类艾美尔球虫各虫种间保守性较高的3．1E基因和a-tubulin基因，以及新近发现的可作为免疫佐剂，具有增强免疫和治疗作用的多功能细胞因子鸡白细胞介素18(ChlL．18)为研究对象，以PVAXl为载体构建并鉴定了PVAX．ct-tubulin真核表达质粒和PVAX．3．1E—ct-mbulin融合基因真核质粒，通过基因免疫途径研究了5种真核表达质粒对免疫鸡的免疫调节机理以及对感染堆型艾

3、美尔球虫暇acervulina)鸡的免疫保护作用，试验内容与结果如下：l以E．acervulina上海株(SH株)6h孢子化卵囊的总RNA为模板，应用RT-PCR技术扩增出含有完整开放阅读框架(ORE)的0【．tubulin基因，该基因片段长为1362bp，经测序鉴定得知E．acervulinaSH株a-tubulin基因eDNA核苷酸序列(HQ259108)与GeneBank参考株相应序列(X88776．1)同源性为99．4％，推导氨基酸序列同源性为99．5％。2通过设计引物将3-1E基因的终止密码子删除，同时去除a-mbulin

4、基因的起始密码子。应用重叠扩增PCR(GenesplicingoverlapextensionPCR，SOEPCR)技术成功地将Eaeervulina3．1E基因和c【．tubulin基因片段进行连接，并在两个基因之间引入了柔性连接肽(G4s)3，获得融合基因3．1E—linker-a．tubulin。以PVAXl为载体成功构建了融合基因的真核表达质粒PVAX．3．1E．a-tubulin，融合基因质粒的体外瞬时转染试验表明，融合基因能够在细胞内进行高效表达，抗3．1E多克隆抗体和抗a-tubulin多克隆抗体分别能与融合基因表达的

5、蛋白发生免疫学反应，表明构建的融合基因表达蛋白很好的保留了融合前两段基因蛋白的生物学潘眭，为后续研究融合基因对球虫感染的免疫保护机理提供了理论支持。3实验分组：实验中构建5种真核表达质粒研究核酸疫苗对机体免疫保护效果，实验分为8组，分别为不免疫不攻虫组(B)、不免疫攻虫组(H)、PVAX空质粒免疫组(PVAx)、PVAX-IL．18真核表达质粒免疫组(IL．18)、PVAX．3．1E真核表达质粒免疫组(3．1E)、PVAX--a-tubulin真核表达质粒免疫组(WDB)、PVAX．3．IE．a．tubulin融合基因真核表达质粒免

6、疫组(3w)、PVAX·3—1E一Ⅱ-tubulin融合基因真核表达质粒+PVAX．IL．18真核表达质粒联合免疫组(3W+)。实验过程中，利用T淋巴细胞转化试验(MTT法)、B淋巴细胞转化试验(MTT法)、流式细胞仪及酶联免疫吸附试验(ELISA)对21、28、35、42、49日龄雏鸡的各项免东北农业大学农学博士学位论文疫指标进行了检测，最后用球虫攻击感染保护试验进一步比较了不同真核表达质粒对球虫感染鸡保护效果的差别，探讨免疫保护机理。4实验结果：雏鸡脾脏、胸腺和外周血T淋巴细胞增殖功能检测试验中发现，各组雏鸡T淋巴细胞增殖功能在

7、28日龄后均出现幅度不等的上升趋势，各实验组均表现出明显增殖活性。其中在49日龄时，3w+组数值最高，其次是3W组，单独免疫组3．1E、a-tubulin和IL．18组数值极显著低于3W+矛H3W组数值，该五组数值和对照组数值相比差异极显著。血液和胸腺T淋巴细胞增殖实验结果，趋势与脾脏结果类似。雏鸡脾脏和外周血B淋巴细胞增殖功能检测试验结果趋势与T细胞检测结果类似。通过流式细胞仪对雏鸡脾脏、胸腺和外周血中CD4+T淋巴细胞数量进行检测发现，各雏鸡CD4+T淋巴细胞数量在28日龄后均出现幅度不等的上升趋势，各实验组均表现出CD4+T淋

8、巴细胞数量增加。在42日龄时各实验组CD4+T淋巴细胞数量达到最高值，其中3w+组数值最高，其次是3W组，单独免疫组3．1E、Q-tubulin和IL．18组数值极显著低于3w十和3W组数值，该五组数值和对照组数值相比差异极显著。血液