华蟾素诱导急性单核细胞白血病凋亡的体外研究

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1、上海第二医科大学硕士学位论文华蟾素诱导急性单核细胞白血病凋亡的体外研究姓名：张莉申请学位级别：硕士专业：内科学（血液学）指导教师：沈志祥2003.5.1华蟾素诱导急性单核细胞白血病凋亡的体外研究中文摘要目的研究(体外)中药华蟾素对急性单核细胞白血病细胞株U937增殖的抑制作用，及其诱导U937细胞株凋亡的作用，并初步探讨其可能的机制。进一步研究华蟾素协同拓扑异构酶II抑制剂(etoposide，VPl6)对急性单核细胞白血病原代细胞的凋亡诱导作用，从而为临床应用华蟾素提供体外实验的证据。方法①通过MTT比色分析华蟾素对U937增殖的抑制作用，通过概

2、率单位回归分析计算华蟾素对U937细胞株的半数致死剂量(IC50)：通过相关分析证实该抑制与华蟾素剂量及作用时间的相关性；②通过Wright’S染色、Hoechst33258荧光染色观察凋亡细胞特征的形态学改变；③通过琼脂糖(Agarose)凝胶电泳、末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT)原位标记两个特异的方法，检测DNA分解片段的产生；④通过流式细胞仪的方法定量检测磷脂酰丝氨酸(PS)外化的AnnexinVoFITC阳性细胞百分数；⑤通过流式细胞仪的方法，检测华蟾素作用后U937细胞株Bcl．2的表达量；⑥通过RT-PCR半定量的方法，检测华蟾素作用后

3、U937细胞株Fas、FasL的表达；⑦通过ELISA的方法，检测华蟾素作用不同时间内U937细胞株的c—AMP含量，初步探讨华蟾素诱导U937凋亡的可能机制；⑧应用上述方法，检测华蟾素协同VPl6对急性单核细胞白血病患者细胞的凋亡诱导作用，通过2x2析因实验方差分析的方法，统计两药协同对诱导原代细胞凋亡的作用。结果①通过MTT比色分析的方法检测，O．225ug／ml以上浓度的华蟾素能够明显降低U937细胞株对NBT的摄取活性，具有抑制增殖的作用(P

4、P<0．01)。通过概率单位回归分析，计算出华蟾素24小时的IC50为1．36ug／ml。②通过Wright’S染色、Hoechst荧光染色的方法观察，O．9ug／ml华蟾素能在体外诱导U937细胞株出现凋亡特征的形兰塑鲞堡壁墨丝兰簦塑些皇垒塑堡圭塑竺竺竺塞一』鲨塑兰望翌塑釜塑坠!兰i兰态学改变。经Agarose凝胶电泳、TdT原位标记的方法检测，华蟾素能在体外诱导U937细胞株产生DNA分解片段。通过流式细胞仪的方法检测AnnexinV．FITC，华蟾素能使U937细胞株的磷脂酰丝氨酸(PS)外化，并与华蟾素具有显著的时间、剂量相关性(r20．9

5、24，r50．979，P<0．01)。③通过流式细胞仪检测anti—Bcl．2．FITC，华蟾素能明显降低U937细胞株Bcl．2表达(1．8ug／ml华蟾素P=0．002，0．225ug／ml华蟾素P=0．039)。通过RT-PCR半定量方法，O．9ug／ml华蟾素作用后U937细胞株的FasL表达量为1．47(FasL／[3．actin)，对照组3．54；Fas表达量为7．72(mFas／p．actin)，并出现可溶性Fas表达6．99(sFas／p—actin)，对照组为4．94。通过ELISA方法检测，0．45ug／ml华蟾素作用6小时后，

6、U937细胞株c．AMP含量明显降低(P<0．01)，18小时抑制率明显增高(P=0．04)。④体外O．225ug／ml华蟾素协同拓扑异构酶II抑制剂(VPl6，10ug／m1)作用2天，可增强对U937细胞株及部分急性单核细胞白血病患者原代细胞的凋亡诱导作用(P=0．048，P=0．025)。结论①中药华蟾素体外具有抑制U937细胞株增殖的作用，该作用呈一定的时间．剂量相关性；②该药具有诱导U937细胞株凋亡的作用；③其诱导U937细胞株凋亡作用，可能通过Bcl一2、c—AMP、Fas、FasL等途径；④华蟾素在体外能协同拓扑异构酶II抑制剂VP

7、l6，诱导急性单核细胞白血病患者原代细胞凋亡。⑤华蟾素是一种治疗急性单核细胞白血病有前景的药物，可辅助化疗药物对白血病的治疗作用。关键词华蟾素，急性单核细胞白血病，凋亡StudyofEffectsofCinobufacinionAcuteMonoeyticLeukemiaCellLine(U937)andParentCellsAbstraetObjective：InvitrostudiesonCellularandMolecularMechanismsofeffectsofCinobufaciniwhichinduceshumanacutemono

8、cyticleukemiaU937cellandparentcellsapoptosis．Methods：U937cell