mTORp70S6激酶信号途径在CHL细胞蛋白质合成中及心肌细胞肥大中的作用研究

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1、中国医科大学博士学位论文mTOR/p<'70>S6激酶信号途径在CHL细胞蛋白质合成中及心肌细胞肥大中的作用研究姓名：赵咏梅申请学位级别：博士专业：细胞生物学指导教师：于秉治2003.4.1中文摘要前言细胞生长是生物大分子合成，导致细胞体积或质量增加。细胞生长不是简单的质量增加，而是发生在特定的时间和地点的受到精细调控的过程，并且与细胞增殖、凋亡相互协调才能长成适宜的细胞、器官或个体。近年来研究表明，雷帕霉素靶(mammaliantargetofrapamycin，mTOR)蛋白在细胞生长的信号转导

2、过程中具有十分重要的作用，是细胞生长的中心调控因子。mTOR属于磷酯酰肌醇激酶相关激酶(phosphoinositidekinase—relatedkina-$es，PIKKs)家族中的新型丝／苏氨酸蛋白激酶。它的两个底物蛋白p”S6激酶(p70S6K)和起始因子4E结合蛋白l(4E—BPl)均是蛋白质合成的重要调控因子。蛋白质合成在细胞生长中起重要作用，它受许多刺激因素的调控，包括胰岛素和佛波酯。以往有关调控蛋白质合成的信号途径的研究多集中于胰岛素。在一些细胞系中，mTOR和pTOS6K受磷脂酰肌

3、醇一3激酶(PDK)、蛋白激酶B(PKB)的调控。PKB位于P13K的下游，受P13K的调控。已有研究表明，胰岛素通过PDK、roTOR依赖性途径促进蛋白质合成。佛波酯(phorbol12一myristate13一acetate，PMA)是PKC的激动剂，它促进蛋白质合成，然而其信号传递途径及其与P13K、mTOR之间的关系目前尚不清楚。LY294002是H3K特异性抑制剂。雷帕霉素(rapamycin)是一种亲脂性大环内酯物，当它进人细胞发挥作用时，首先与其细胞内受体FKS06结合蛋白(FKBPl

4、2)形成复合物，rapamycin—FKBPl2复合物的细胞内靶蛋白称为mTOR(mammaliantargetofrapamycin)。Rapamycin能特异性抑制roTOR激酶活性。因此，本研究分别用rapamycin或LY294002预处理、PMA或胰岛素处理血清饥饿的中国仓鼠肺成纤维细胞(Chinesehamsterlungcells，CHL)，检测p”S6K和PKB的活性变化及其表达，探讨PMA和胰岛素在蛋白质合成中的信号传递及其与PDK、mTOR之间的关系，为进一步研究蛋白质合成、细胞

5、生长、增殖等领域提供理论依据。心肌肥厚与各种心脏事件的发生密切相关，是独立的心血管病危险因素，然而其确切机制尚不清楚。目前研究认为，各种生长因子、神经递质、机械应力等刺激，通过激活细胞内信号传递途径引起的蛋白质合成增加、细胞过度生长，是高血压病发生心肌细胞肥大、心肌肥厚的主要机制。心肌肥厚的细胞学特征主要表现为：细胞体积增加、蛋白质合成增加。Rapamycin通过特异性抑制mToR激酶活性，抑制mTOR／p”S6K信号通路的激活。有研究表明，Raparnyein抑制血管紧张紊Ⅱ、苯肾上腺紊、异丙肾上

6、腺素、缓激肽等诱导的胎鼠心肌细胞的肥大、P加S6K的活化及蛋白质的合成等。roTOR是细胞生长的中心调控因子，p70S6K是调控蛋白质合成的关键信号分子。因此mTOR／p”S6K信号途径可能在心肌细胞肥大、心肌肥厚的发生中起重要的调控作用。另外，饥饿培养的新生大鼠的心室肌细胞处于终末分化状态，而不重新进入细胞周期。在生长因子的刺激作用下，这些细胞只发生肥大反应而不发生细胞分裂，从而避免受到细胞周期进程的复杂影响。因此新生大鼠心室肌细胞是研究细胞生长的理想模型。为此我们原代培养新生大鼠的心室肌细胞，应

7、用rapamyein预处理、20％胎牛血清处理血清饥饿的心肌细胞，观察心肌细胞表面积、蛋白质含量及p70S6K的活性改变。同时选用自发性高血压大鼠(spontaneoushyporten．sirerat，SHR)为实验对象，研究心肌肥厚时，形态学和血液动力学参数改变、左室心肌ⅡlTOR和p”S6K的表达及活性变化，旨在揭示mTOR／p∞S6激酶信号通路在心肌细胞生长、心肌肥厚中的作用和机制。方法1．细胞培养及细胞周期同步化(1)中国苍鼠肺成纤维细胞系(CHL)由中国医科大学遗传教研室提供，用DMEM

8、(dulbeccogmodifiedEagle'smedium)培养基加10％的56。C灭活的胎牛血清，滤膜除菌。将5×105细胞接种于250ml培养瓶中，隔天换液。细胞长满至70％时改用不加胎牛血清的DMEM，饥饿培养18h，此时细胞同步于c0／g。期。(2)新生大鼠心室肌细胞(neonatalratventricularmyoeytes，NRVMs)的培养：取1—3d龄的SD乳鼠，无菌条件下取出心室，剪成lmm3大小碎块，0．25％胰蛋白酶消化，静置8一10分钟，