IFN作用下HBV变异机制的体外实验研究

《IFN作用下HBV变异机制的体外实验研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、中山大学硕士学位论文IFN作用下HBV变异机制的体外实验研究姓名：王卫峰申请学位级别：硕士专业：消化内科学指导教师：周晓东2003.5.18IFN作用下HBV变异机制的体外蜜验研究摘要IFN作用下HBV变异机制的体外实验研究4专照：消忧痣褥学磺±研究生：壬里峰导师：周晓东教授摘要，f我国是艺型肝炎的离发鹾，HBV的慢性感染与各种肝瘸的发生枣饕密切螅关{系，埒尊致瀵犍添动鼙瓣爱、翳嫒他，翳缨魏痿等貘病戆发懋。提统计，髅赛上大约3绽人妇揍带有HBV，蔡孛25％最终将愆予翳骥纯或群瘘。InterferonfIFN)楚譬翦馨离辫公

2、试钵内清豫己鼙脬炎病毒(HBV)律掰较叠手的药物，魏治疗乙黧群炎瓣主要药物之一。tFN翁侮薅只嫩予复裁麓HBVDNA，势不能清豫缁稳核内豹复制横税cccDNA，也难以清除已与宿童DNA熬合的病毒基因。HBV基麟缀系双黢强’捩DNA，英按彗黢(哟长黢为3。2kb，共努4个开放滚码框架(ORF)，分别编码外膜蛋白、核心鬣白、X抗原和DNA多聚酶。它们都可以发生畿雾，缴发生黪颁零、类涎霸意义不霞。萝暑缡越浆裔：点突交(聱换)、缺失、插入、重复、藏组、璧排。其中以点突变最鬻见，冀次为缺失著口捶入变具。变舞豹结袋霹姥发黛辩病爨鱼骞爨

3、致死经验或毒蒜酌泼燹(爱健透耩)；逛掰§g是曼露效款在黪缨腿内袈剩斡毒辣<逶慰蛙选撵，adaptiveselection)，或馕煞遴避受疫或癸爨溃豫瓣毒株蠢德势f免疫选择，immuneselection)。棱赞类药秘蔗邋霉来方麓予抗荔嫠翳炎瘸毒恕嚣躲，箕长期渗疗霹爨零数^____E=___《#‰HBV燹辩已经达成共谈，而IFN是较草应用于抗乙肝瘸毒的药物之～，IFN遐荫诱导己髓痣警交弊基游毒在饕蚕瓣寒熨。有残究纛谈魏，HBeAg鬻稳豹浸毪己翳■#=#-_■目!■‘患者粥IFN治疗后血清HBeAg的阴转弗不一意袭示HBV复制

4、停止，而有诱发潜在蘸C嚣终止变赛懿筲麓，弱Lok等学者蕊磷究绪条议为IFN治疗势不壤趣HBV‘本研究为鬻家科技帮973计划项目G1999054105资助～l一!型缝旦!坚!∑壅墨垫型塑竺竺塞塑憩壅，一一．一塑前C区变异的机会。避来，Radecke簿研究发现高剂爨IFN治疗对前C／C基因产生影确，发蕊HBcAg骞稳定懿爨基致替代。裘璃褰裁霪IFN慰HBcAg免囊显毪表位存在选择作用。关于IFN作用下HBV变异的机制，一些学者认为是逃避免疫压力静结采。德Rehermarm等发现後瞧脬炎不翁裣溺劐HBcAg多壳陵CTL反应，并虽

5、发现此静瓣象与CTL表搜的变暴涎关。势且，已掇道螅C基因热点变舅均不在MHC限制慌CTL识别区，最常见的L97替代甚至岛已知的T或B农位无兼。嚣照，IFN治疗居薪产生酶HBV变异，能瑶塞接照霞予诱导瀵德煞撬傣免疫疆力，尚需深入研究。我翻裁IFN侮爰下HBVC基霆及箕疟动予翡变暴及壤裁骚开系统鳃薅静实验研究。＼夕／秘熨垦的；用不同剂缀IFN反复作用HBV分泌型HepG2．2．15细胞培养株，筛选HBV抗原表达隅性耆，经过测序的方法鉴定HBVC萋因及C蓥嚣癌动子交彝，魇clustalx等软件对序列进行分析，通过实验对比基因序列

6、的差异，综含分析其突变的规律及意义，力搽讨IFN致HBVC鏊嚣及葵嘉动予变异赫多重瓿剿提供科学嚣依据。，∥4、，—一”、≮、磷帮内容：1+li蝥圣分泌墼HepG2。2．15缝魏系懿薅势培养2。IFN耐照株的筛选t』；=j中3。鞋BVe蓥嚣及CP基因麴竟溪与鉴定4。基因测序与分析／／穷法：。{、将HepG2．2，15细胞悬液调整为4×10i／m1，分组搂种于六孔板，每孔2ml，培莠3d，缨憝生长凌卷藏好，该壤募维鼹探溪子实验磷嚣。实验缓每瑟按滚，培养液含不同浓度IFN，连续培养20d，最艨一次换液(用无姐清DMEM培券滚)后

7、细臆继续培棼48hr，餐取秘上清立鞭子．20℃保存祷溯。采掰台酚蘸摊斥试验检测细胞一l{一t型焦旦：!!!!型墨!型!堕竺丛壅墅婴塑——一一———————!旦墨活力．WesternBIot方法检测培养上消中AFP表达。掇取细胞上清中的HBVDNA，寝曩g。懿￡ban靶中HBV鑫yw泛型全鏊霹序列，选簿保毒区蠛设诗出特吴注；{耱，以提取物为模板进行PCR扩增HBVC基因及其启动子，PCR产物经电泳、回收、纯诧、如嚣西装入下载{奉，将蕈巍旗粒转化避入JMl09，缀蓝自筛选后随机挑取菌落测序。测序结果艨clustalx等软件进行

8、分析。缱巢：l。培养上瀵中AFP的WesternBlot检测结果在69KD位嚣上的疆白能特异性地被AFP多抗识别，有明显的抗原一抗体反应。对照缀与实验缀分拆数握磐下表：对袁中数据进行肇因素方差分析：方差齐性检验：p=0．272方激齐蠢差分橱：P=0+870(P>G．05)各缝之闻曩羚不显著2．细胞上清中