使用柱后光化学衍生高效液相色谱荧光检测法测定酸枣仁和陈皮中的四种

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1、使用柱后光化学衍生-高效液相色谱-荧光检测法测定酸枣仁和陈皮中的四种黄曲霉毒素应用简报制药行业作者摘要杨新磊本文介绍了使用Agilent1260Infinity四元高效液相色谱-荧光检测器系统，通过柱后光安捷伦科技（中国）有限公司化学衍生的方式建立了酸枣仁和陈皮中黄曲霉毒素污染量的测定方法。该方法线性范围好、灵敏度高，对黄曲霉毒素B1的定量限可达0.33μg/kg，远低于2015年版《中国药典》关于中药材、饮片及制剂中黄曲霉毒素污染量的限定值。相比于柱后碘化学衍生，光化学衍生成本低廉、操作简单，更适合于中药材及相关产

2、品中黄曲霉毒素的快速、有效测定。前言中药材生产、加工、贮藏、运输的过程复杂，耗时长，加之部分药材具有含油脂多、含1糖量大等特性，使得中药材很容易发生霉变而产生黄曲霉毒素。黄曲霉毒素的毒害巨大，其毒性相当于氰化钾的10倍，砒霜的68倍。常见的黄曲霉毒素主要为B1、B2、G1和G2。2015年版《中国药典》较之2010年版对于黄曲霉毒素的控制更加严格，增加了十多种中药材及饮片中黄曲霉毒素污染量的测定，明确规定药材中B1的残留量不得超过25μg/kg，B1、B2、G1和G2的残留总量不得超过10μg/kg。3关于黄曲霉毒

3、素的测定有很多方法，如液相色谱-荧光检测法、液相色谱-质谱联用法、酶联免疫吸附法和薄层色谱法等。为防止黄曲霉毒素B1和G1的荧光淬灭现象，液相色谱-荧光检测时需进行衍生后方可测定，常见的衍生方法有柱后碘化学衍生、柱后电化学45（溴）衍生、柱前三氟乙酸衍生、柱后光化学衍生等方法，每种方法都有各自的优缺点。考虑到购买成本及操作简易性问题，对于大部分质量控制部门而言，柱后光化学衍生-液相色谱-荧光检测法最为合适。实验部分至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)过滤，量取续滤液20mL，通过免疫亲和柱，流速每分钟3mL，用

4、水20mL洗脱，洗脱液仪器弃去，使空气进入柱子，将水挤出柱子，再用适量甲醇洗脱，收Agilent1260Infinity四元高效液相色谱系统，含有四元泵集洗脱液，置于2mL量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀即得。(G1311B)、自动进样器(G1329B)、柱温箱(G1316A)、荧光检以黄曲霉毒素B1限量不超过5μg/kg换算，该供试品溶液中B1测器(G1321B)、柱后光化学衍生装置(LCtech)和OpenLab的浓度不得超过3ng/mL。ChemStationC0105版本软件。自动进样器至柱温箱加热模块采用

5、0.25mm内径×320mm的不锈钢毛细管（部件号：79835-液相色谱条件®87638）进行连接。AflaTestP免疫亲和柱购自VICAM公司。色谱柱AgilentZorbaxPlusC18，4.6×150mm×5µm试剂柱温30°C乙腈、甲醇为色谱级，购自Merck。水为MilliQ纯化水。黄曲检测器*激发波长：360nm；发射波长：450nm；霉毒素混合标准品购自Sigma-Aldrich公司。增益：12；采样频率：2.31Hz供试品和对照品制备流动相水/甲醇/乙腈=60/30/10（体积比）混合对照品溶液制

6、备（参考药典方法）流速1.5mL/min精密量取黄曲霉毒素混合标准品（黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2进样量5-25µL标示浓度分别为1.0、0.3、1.0、0.3μg/mL）0.5mL，置于10mL运行时间15min量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为储备液。精密量取储备液*不同检测器可能需要调节乘积因子，本实验所用乘积因子为101mL，置于25mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得混合对照品溶液，黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2浓度分别为2、0.6、2、结果与讨论0.6ng/mL。系统适用性供试品溶液制备（参考药典方法）

7、按上述液相色谱条件，取黄曲霉毒素混合对照品溶液5μL进样，取供试品粉末约15g（过二号筛），精密称定，加入氯化钠3g，所得色谱图如图1所示。可以看出最低上样量5μL时，各物质信置于均质瓶中，精密加入70%甲醇溶液75mL，高速搅拌2分钟噪比均大于10，相邻两峰分离度均大于1.5，完全满足2015年版（搅拌速度大于11000转/分），离心5分钟（离心速度2500转/《中国药典》系统适用性要求。分），精密量取上清液15mL，置于50mL量瓶中，用水稀释9.629-B1LU13.47.811-B213.2136.642-

8、G15.516-G212.812.612.412.21211.802468101214min图1.黄曲霉毒素混合对照品溶液色谱图（进样量：5μL），出峰顺序为G2、G1、B2、B12线性范围、重复性和定量限按照2015年版《中国药典》要求，分别取黄曲霉毒素混合对照品溶液5、10、15、20、25μL进样，得到各黄曲霉毒素标准曲线（见图2），其线性相关系数均大