DNA芯片原位合成和检测新技术研究

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1、东南大学博士学位论文DNA芯片原位合成和检测新技术研究姓名：贺全国申请学位级别：博士专业：生物医学工程指导教师：陆祖宏20030101PDMS印章阵点高度为5．0X10m，其膜厚为1．0X10。3Ill时．硅烷化修饰基板的印章绝对角度扭曲0I小于3．98X10，相对角度扭曲02小丁1．22x10，完全能够满足软光刻技术制备DNA芯片时微米级多层次准确定位的要求。2．提出并实现了将所有多层PDMS印章集成在同一固相平面的大面积PDMS印章的思路．解决了不同印章与合成基片之间压印合成反应的准确定位问题；提出了用表面镀铝(银)玻璃板作印章母板的方法，解决了大面积PDMS印章和其母板之间的脱模问题

2、，确保了PDMS印章高保真地复制出模板的图案，此时印章线收缩小于0．043％，阵点面收缩小于0．3％；据此制备出高质量、高分辨、集成化的PDMS大面积弹性体PDMS印章，利用上述方法在一块0．18m×0．26m玻璃板上制备出168个PDMS印章，为分子印章法用于高密度DNA芯片技术的实用化奠定了重要的基础。3．亲水性PDMS印章的制备是软光刻技术制各DNA芯片的关键。文献上报道的采用氧等离子的PDMS表面处理会破坏印章上的微结构与形貌，从而难以实现软光刻技术合成DNA的微阵列所要求的大面积多次压印图型保型转移。本文提出了一种非损伤性的适用于大面积PDMS印章表面改性的方法。该方法采用氩氢混

3、合气体等离子的预处理PDMS表面后，藉用丙烯腈的接枝聚合对其表面进行亲水改性，实现了氰基朝外的定向接枝。经改性屙的PDMS表面，对乙腈接触角为17±7。，保证了对乙腈为溶剂的DNA合成试剂的良好浸润铺展和图案转移，弗能完好地保证原始的微结构与型貌。实验表明：丙烯腈接枝后的PDMS印章表面具有对反应极性溶剂的良好的相容性以及对转移和压印反应试剂的化学惰性。4．构建了软光刻技术制备DNA芯片高精度定位压印系统，对提出的压印偶联反应和压印脱保护(脱对二甲氧基三苯基(DMT))反应二种制备DNA芯片的丁艺路线进行了比较研究。研究发现压印偶联反应可以提高偶联效率与阵点的均匀性．并确定了压印偶联反应为

4、制备DNA芯片的工艺路线。用压印偶联反应合成了20met的寡核苷酸，通过末端荧光基团法测得压印偶联反应的单步合成产率大于97％，高于Affymetrix光脱保护法的90％。优化了软光刻技术制各DNA芯片的上艺路线，并成功地应用软光刻技术制矫出高密度DNA芯片：获得了点阵数为10K／cm2的相同序列的寡核苷酸微阵列芯片，各阵点上寡核苷酸的杂交荧光强度基本均匀一致，说明每个阵点的偶联效率一致；制各山点阵数为2500／cm2的不同序列的寡核苷酸微阵列，通过与靶序列杂交，实现了单个碱基错配的检测。本文在时间分辨荧光标记的DNA芯片新型检测技术方面，合成了一系列具有时问分辨荧光性质的BCPDA与铕(

5、III)系列的配合物探针，对它们的荧光性质与DNA芯片标记检测J知心进行了可行性研究与探讨。主要研究结果包括如-卜：1合成了一系列具If时间分辨荧光性能的配何化合物的配体：BCPDA、BSPDA年¨它们的一糸列氨基衍生物；同时台成了这些配体‘。销(III)离子的配合物，研究了在不同配比¨(BCPDk：Eu=l：1或2：1)时配合物的荧光性质．结果发现在紫外光激发下，这些配‘T、7一合物可发射出铕(III)的特征谱线尤其是川。一，z的特征谱线，并具有数百微秒以上K的荧光寿命。研究了经BCPDA衍生后的在不同固相载体表面对铕(HI)离子的配位捕获特性。研究表明这些表面BCPDA衍生与铂(HI)

6、捕获是成功的，衍生后的玻片、白碳黑和氢基多孔聚丙烯膜等载体都能发射铕(ⅡI)离子长寿命荧光，其荧光寿命均在数百微秒以上。其中氨基多孔聚丙烯膜上的荧光寿命最长，达毫秒以上。因此，这种膜可用作实现时间分辨荧光检测DNA芯片的良好载体。提出并实现了基于时间分辨荧光技术的新型DNA芯片分析检测方法，可以实现正配、单碱基错配、二碱基错配、三碱基错配的差别检测。实验表明，BCPDA标记后的亲和素能保留较大的生物素结合活性，可应用于DNA微阵列的时间分辨荧光检测。制备了基于纳米金的BSPDA组姨层，通过配位作用可捕获铕(III)。研究发现，纳米金对铕(III)的非特异性吸附与BSPDA对铕(III)的选

7、择性配位吸附的时间分辨荧光强度有较人的筹别，这可望发展成为一种新的高灵敏度DNA检测技术。AbstractAsananalyticalmethodforhighthroughputscreeningsimultaneously,DNAchiptechnologyhasgainedrisingimportanceinrecentyears．DNAchips，orDNAmicroarrays，beartensofthousa