广东工业大学-生化分离技术-doc1

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1、下游技术n第一章提取与沉淀分离技术v生物大分子是指在生物体内存在的具有特殊生物学功能的高分子化合物，主要包括蛋白质、酶、核酸、多糖和脂类。v提取的概念：在一定的条件下，用适当的溶剂（溶液）处理原料，使欲分离物质充分溶解到溶剂（溶液）中的过程。也叫抽提。提取液-固提取液-液提取（萃取）n细胞破碎v定义：细胞破碎是指选用物理、化学、酶或机械的方法来破坏细胞壁或细胞膜v目的：破坏细胞的外壳，使细胞内含物有效地释放出来，获得有效的提取。v对于胞内产物需要收集菌体或细胞进行破碎。　n细胞壁结构对破碎的影响Z细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。Z不同细胞壁的结构和组成不完全

2、相同，故细胞壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就不同。Z几乎所有细菌的细胞壁都是由肽聚糖组成，它是难溶性的聚糖链；Z相邻聚糖链上的短肽又交叉相联，构成了细胞壁的三维网状结构，包围在细胞周围；Z使细胞具有一定的形状和强度。Z破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构，其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联的程度。*（细胞破碎方法机械破碎法高速组织捣碎机匀浆器研磨器物理破碎法化学破碎法酶学破碎法（物理破碎法的分类温度差破碎法把待破碎的样品通过温度的反复变化而使细胞破碎。压力差破碎法：通过压力的变化，使细胞内与细胞外所受的压力不同，而

3、使细胞破碎。超声波破碎法通过超声波的作用，使细胞结构解体，而使细胞破碎。v化学破碎方法n化学破碎方法：通过化学试剂的作用，使细胞膜的结构改变或破坏，使细胞膜的透过性改变。n常用的化学试剂可分为有机溶剂和表面活性剂两大类。n十二烷基硫酸钠：SDSv酶学破碎方法n酶学破碎方法：利用溶解细胞壁的酶(外加的或细胞本身存在的酶)处理菌体细胞，使细胞壁受到破坏后，再利用渗透压、冲击等方法破坏细胞膜n分为：外加酶制剂和自溶法。但对于革兰氏阴性菌，单独采用溶菌酶无效果，必须与螯合剂EDTA一起使用。原其细菌的壁外层结构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维

4、持，一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。提取方法1.盐溶液提取法盐溶：在低浓度盐溶液中，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加。盐析：当盐浓度达到某一界限后，蛋白质的溶解度随盐浓度升高而降低。2.酸溶液提取法3.碱溶液提取法4.有机溶剂提取法常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、丁醇等。v影响提取的因素（P8）1.溶解度2.扩散速度3.温度4.pH值5.提取液的体积等电点：在某一个特定的pH值条件下，分子上所带的正、负电荷相等，净电荷为零，此时的pH值即为该分子的等电点。蛋白质在等电点下溶解度最小第三节沉淀分离生物大分子的

5、分离方沉淀分离盐析沉淀法等电点沉淀法有机溶剂沉淀法金属盐沉淀法复合沉淀法选择性变性沉淀法层析分离电泳分离超离心分离v沉淀分离的定义：通过改变某些条件或添加某种物质，使某溶质在溶液中的溶解度降低，从溶液中沉淀析出，而与其他溶质分离。v（P10）1.盐析原理：蛋白质在水中的溶解度受到溶液中盐浓度的影响。在某一浓度的盐溶液中，不同蛋白质的溶解度各不相同，由此可达到彼此分离的目的。n反离子作用改变了蛋白质分子表面的电荷。离子的存在使蛋白质的水化膜改变。v盐的选择n蛋白质和酶的盐析通常采用中性盐。n其中在实际中应用最广的是硫酸铵（因为硫酸铵有温度系数小而溶解度大的优点

6、，并且硫酸铵分段盐析效果比其它盐好，不易引起蛋白质变性。）v盐析时的注意事项1.添加的硫酸铵的纯度要高。并要使其充分溶解。2.在同一溶液中欲分离几种蛋白质时，可采用分段盐析的方法。3.盐析操作一般可在室温下进行，而某些对热特别敏感的酶，则应在低温条件下进行。1.选择适当的蛋白质浓度，避免共沉淀作用。2.沉淀要脱盐纯化。v等电点沉淀法n沉淀原理：利用蛋白质在等电点时溶解度最低以及不同的蛋白质具有不同的等电点这一特性，将不同蛋白质进行分离。n在实际使用时等电点沉淀法经常与盐析法或有机溶剂沉淀法联合使用。n加酸或加碱调节pH值过程中，要防止局部过酸或过碱。v、有机

7、溶剂沉淀法n沉淀原理：利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度不同而使蛋白质分离。n优点：分辨力比盐析法好，溶剂容易除去且可回收。n缺点：易使蛋白质和酶变性操作要点有机溶剂：常用乙醇和丙酮温度：低温离子强度：加入盐（减少蛋白质变性，提高分离效果）的浓度不宜太高第二章n过滤与膜分离技术的定义n粗滤和部分微滤采用高分子膜以外的物质作为过滤介质，称为非膜过滤，简称为过滤。n大部分微滤以及超滤、反渗透、透析、电渗析等采用各种高分子膜为过滤介质，称为膜过滤，又称为膜分离技术。n.加压膜分离1）微滤2）超滤3）反渗透电场膜分离2）（1）电渗析离子交换膜电渗析第三章萃

8、取分离技术v萃取分离原理：组分在两个互不相溶的液相中