乌贼墨多糖干预环磷酰胺介导小鼠睾丸生殖细胞凋亡与自噬的机制研究

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1、分类号：TP242.2密级：UDC:621.865.8学号：2111204308广i海洋太考硕士学位论文乌贼墨多糖干预环磷酰胺介导小鼠睾丸生殖细胞凋亡与自噬的机制研究谷毅鹏指导教师：刘华忠教授串请学位类别：工学硕士专业名称：水产品加工及贮藏工程研究方向：海洋生物活性物质研究与开发学院名称：食品科技学院中国•湛江2015年6月学位论文答辩委员会组成主席：委员：导师：时间：2原创性声广东海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研

2、究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权广东海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于1、保密□，在______年解密后适用本授权书。2、不保密□√。（请在以上相应方框内打“√”）作者签名：年月日导师签名：年月日乌贼墨多糖干预环磷酰胺介导小鼠睾丸生殖细胞凋

3、亡与自噬的机制研究摘要环磷酰胺（cyclophosphamide，CP）是目前临床上应用最广泛的烷化剂，本身并无抗肿瘤活性，只有在体内经代谢后才发挥抗癌作用，而丙烯醛（acrolein，ACR）就是CP的主要代谢副产物，但其具有很强的氧化性，能导致性腺损害。大量研究也表明CP对雄性生殖系统具有明显的损伤作用，但其损伤机制至今尚未明确。本研究从分子角度出发，对CP的生殖毒性机理进行探讨，发现CP代谢产物引起的睾丸氧化应激损伤并诱导生殖细胞凋亡可能是其产生生殖毒害的重要因素。结果显示，经CP处理后，小鼠出现明显的体重减轻，睾丸曲细精管空洞化，生精细胞层数减少，精子大量畸形；睾丸组织氧化

4、/抗氧化平衡被破坏，细胞内ROS和MDA含量都明显升高，而抗氧化酶SOD和CAT的活力均显著下降，生殖细胞出现氧化应激损伤，细胞结构受损；精原细胞和Sertoli细胞内核碎断或固缩，大量线粒体肿胀且内嵴消失，Leydig细胞中产生大量自噬泡，并且有自噬体产生；TUNEL检测睾丸组织中细胞凋亡率明显上升，凋亡的阳性细胞主要分布于精原细胞层内；Westernblot检测睾丸内自噬相关蛋白LC3和Beclin-1的表达量也显著上调，免疫荧光检测这两种蛋白主要集中表达于间质细胞层内。说明在该条件下，精原细胞和Sertoli细胞以凋亡为主，Leydig细胞以自噬为主。体外实验发现，当用CP代

5、谢产物ACR刺激Leydig细胞后，细胞活力随ACR浓度呈剂量依赖性下降，细胞内T-AOC、SOD活力也都显著下降，MDA含量明显升高，细胞氧化应激严重；Leydig细胞分泌睾酮的功能也明显受损；Leydig细胞在ACR的刺激过程中，分别出现明显的自噬和凋亡，其中自噬早于凋亡发生，一旦自噬被抑制便会引发凋亡，暗示凋亡和自噬之间是对抗关系。自噬和凋亡可相互调节，两者之间也存在着相同的调控因子，如p38MAPK和PI3KI/Akt信号通路。本研究结果显示，在CP诱导的自噬和凋亡中，p38MAPK和PI3K/Akt信号通路均被激活。在Leydig细胞的体外试验中还发现，p38MAPK不仅

6、促进ACR诱导的自噬，当自噬能力超负荷时，p38MAPK通路还能启动促凋亡程序，诱导凋亡。乌贼墨多糖（squidinkpolysaccharides，SIP）是具有化疗保护作用的海洋活性物质，对CP造成的雄性生殖毒害具有明显的抑制作用。本研究以SIP的纯化组分SIP-1作为细胞保护剂，以期在细胞与分子水平上去精确阐释SIP干预CP致细胞毒性的分子机理。结果显示，SIP-1能有效缓解CP对睾丸组织的氧化损伤，提高睾丸中SOD和CAT的活力并降低MDA的含量，清除组织内积累的过量ROS，防止睾丸曲细精管结构损伤，提高生精细胞数目，降低畸形率，避免小鼠体重的下降。体外条件下，ISIP-1

7、也能对ACR刺激下的Leydig细胞产生明显的保护作用，提高细胞活力，抑制氧化应激损伤，还能减弱ACR对睾酮分泌的抑制作用，保护Leydig细胞的分泌功能。说明SIP-1主要通过其抗氧化作用来启动其细胞保护作用。SIP-1对细胞内氧化/抗氧化平衡的维持，可避免剧烈的氧化应激作用对线粒体结构的破坏，并阻断凋亡执行因子Caspase-3的激活，下调Bax/Bcl-2比率，从而抑制生殖细胞的凋亡。同时，SIP-1也能降低细胞内自噬相关蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ的高表达