冷诱导rna结合蛋白在h1n1流感病毒复制中的作用及其靶蛋白的筛选

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1、硕士学位论文题目冷诱导RNA结合蛋白在H1N1流感病毒复制中的作用及其靶蛋白的筛选作者冯晓辉完成日期2015年5月5日学科门类农学专业预防兽医学研究方向病原与机体互作指导教师汤承教授学院（系、部）生命科学与技术学院授予学位日期年月日ThefunctionofcoldinducibleRNA-bindingproteininthereplicationofH1N1virusandscreeningofitstargetproteinsByXiaohui-FengATHESISSubmittedtoSouthwestUniversityforNationalitiesinFulfillmento

2、ftheRequirementsForMasterDegreeSupervisor:ProfessorTANGChengCollegeofLifeScienceandTechnology,SouthwestUniversityforNationalitiesChengdu,610041,P.R.China摘要冷诱导RNA结合蛋白（Cirbp）是在哺乳动物体内鉴定的首个与冷应激相关的蛋白，广泛表达于多种组织与细胞中，在脊椎动物间高度保守。在多种应激条件下Cirbp表达升高，并发挥细胞保护作用。此外，Cirbp在胚胎发育，神经发育，生物钟调节，肿瘤发生等过程中发挥重要的调节作用；近期研究表明Ci

3、rbp介导了多种病理条件下的炎症反应，如LPS刺激，脑缺血性休克，脓毒血症，酒精刺激等。本实验室前期研究结果表明，H1N1PR-8流感病毒感染SPF小鼠后，各组织器官中Cirbp在mRNA和蛋白水平上都有不同程度的升高;过表达的Cirbp能通过上调NF-KappaB信号通路显著促进H1N1甲型流感病毒的复制,但Cirbp对病毒复制过程的影响还不清楚。为了进一步探讨Cirbp在病毒复制过程中的作用及机制，筛选Cirbp相互作用的靶蛋白，我们进行了以下研究，主要取得了以下成果：1H1N1流感病毒感染细胞后Cirbp表达升高并发生核质穿梭为了搞清楚Cirbp在H1N1感染的细胞内的表达规律，本试验

4、将H1N1流感病毒以MOI=1分别接种三种细胞,其中BHK-21（叙利亚仓鼠肾细胞），和MH-S（小鼠肺泡巨噬细胞）接种人A/PuertoRico/8/1934H1N1，PUVEC（猪血管内皮细胞）接种猪A/Swine/GD/2/12H1N1。分别于感染后0h，4h，8h，16h，24h取样，用免疫组化法检测各细胞各时间点Cirbp的表达情况并用IPP6.0软件进行半定量分析。结果显示：感染PR-8H1N1甲型流感病毒后8h～24h，BHK-21细胞中Cirbp的表达水平升高，达到了差异显著水平；感染PR-8H1N1甲型流感后4h～24h，MH-S细胞中Cirbp的表达水平显著升高；感染猪H

5、1N1流感病毒后8h～24h，PUVEC细胞中Cirbp的表达水平显著升高。为了探讨H1N1流感病毒感染下Cirbp在细胞内的亚定位，本试验将H1N1流感病毒以MOI=1感染BHK-21细胞，分别在感染后2h，4h，6h，8h对样品进行间接免疫荧光染色，并在激光共聚焦显微镜下观察结果。结果显示，H1N1流感病毒感染后2h，Cirbp定位于细胞核与细胞浆中；感染后4hCirbp主要定位于细胞核中；感染后6hCirbp定位于细胞核与细胞浆中；感染后8h，Cirbp主要定位于细胞核中。鉴于Cirbp在生理条件下存在于细胞核中，因此此结果表明在H1N1病毒感染条件下，Cirbp可反复穿梭于细胞核和细

6、胞浆之间。上述结果表明，H1N1流感病毒感染情况下，细胞中Cirbp表达上调，并且发生了核质穿梭，为进一步研究Cirbp在流感病毒复制过程中的最用奠定了基础。2敲低Cirbp降低了H1N1流感病毒mRNA的稳定性从而抑制病毒的复制为了证实Cirbp对H1N1病毒mRNA稳定性、RNA合成以及蛋白合成的影响，本试验用Real-timePCR方法检测了敲低Cirbp的BHK21细胞（Cirbp-BHK-21）感染H1N1病毒（MOI=1）后病毒M和NP基因mRNA的半衰期，结果表明，敲低Cirbp后H1N1病毒NP基因和M基因mRNA的相对半衰期分别约为7.5h和8h，对照组中M基因和NP基因m

7、RNA的相对半衰期都超过了12h；同时用Real-timePCR分析了H1N1流感病毒感染（MOI=1）后3h，9h，15h，21h敲低Cirbp对病毒M基因mRNA合成的影响，结果显示，敲低Cirbp显著（P<0.05）抑制了H1N1病毒M基因mRNA的合成，试验组分别是对照组的21.3%，18.6%，12.4%，7.6%，感染后15h和21h，其抑制作用达到了极显著（P<0.01）水平；用Real-tim