g蛋白偶联受体激酶5在胚胎造血过程中作用的分析及其相互作用蛋白的筛选

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1、复旦大学硕士学位论文G蛋白偶联受体激酶5在胚胎造血过程中作用的研究及其相互作用蛋白的筛选相互作用。在HEK293T细胞中通过免疫共沉淀实验发现GRKS与G戌L气2存在相互作用。接下来通过体外结合实验，我们将纯化的GST或GST-GAI’A2蛋白与Flag一HA一GRKS和GsT偶联的琼脂糖树脂一起孵育，得到的免疫复合物用SDS一队GE进行分离，再用W匕StemBlot方法进行检测，发现GRKS和GATAZ存在直接的相互作用。3、从野生型及GRKS基因敲除的成年小鼠眼眶静脉丛采血后检测外周血常规，发现与野生型小鼠相比，GRKS基因敲除的成年小鼠外周血中白细胞显著减少且主要为粒

2、细胞的减少，红细胞和血小板数目二者之间无差异。4、通过分别在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和人乳腺癌细胞(MDA一MB一231)中过表达GRKS，运用免疫沉淀/质谱的方法检测了与GRKS有相互作用的蛋白，分析后结合免疫沉淀实验也对其进行了验证，我们发现，这些蛋白可大致分为三类:与RNA剪切相关的蛋白;与DNA损伤修复相关的蛋白;细胞骨架相关蛋白。这些都提示GRKS可能通过这些与其相互作用的蛋白发挥多种多样的目前还未知的功能。5、综上所述，本研究发现了GRKS在小鼠胚胎造血中的调节作用及其对成年小鼠血液系统的影响，并新发现了一些与GRKS存在相互作用的蛋白。其中，GRKS基因

3、敲除后会导致小鼠胚胎血岛发育受损，且成年小鼠外周血中白细胞的数目显著减少，而外周血中白细胞的降低主要是粒细胞绝对数的减少。通过免疫沉淀/质谱实验，我们发现与GRKS存在相互作用的蛋白中，一部分参与RNA的剪切;一部分与DNA损伤修复相关;还有一部分属于细胞骨架相关蛋白，这些都提示GRKS可能通过这些与其相互作用的蛋白发挥多种多样的目前还未知的功能，对于研究GRKS的新功能有一定的提示作用。关键词:G蛋白偶联受体激酶5;胚胎发育;胚胎造血复旦大学硕士学位论文G蛋白偶联受体激酶5在胚胎造血过程中作用的研究及其相互作用蛋白的筛选AbstractGProtein一eouPledre

4、eePtor(GPCR)15thegreatestfalllilyofmembranereeePtors.ItPlaysakeyroleintransdueingbroadextraeellularsignalsineludinghormones，ehemokines，neurotransmittersandotherenvironmentstimuliintotheintraeellular.GProtein一eouPledreeePtorkinases(GRKs)areknownasalargefamilyofserine/threoninekinasethatregu

5、lateGPCRsignaling.GRKsinteraetwiththeagonist一aetivatedGPCRstoeatalyzerecePtorPhosPhorylationandsubsequentlyleadstotheinternalizationanddesensitizationofGPCRs.Inmammalian，theGRKseonsistofsevenmembers(GRKI一7)，whieheanbedividedintothreesubfamiliesbasedonthesequeneeandfunetionalsilnilarities:(

6、1)therhodoPsinkinasesubfalnily(GRKIand7):(2)the日一adrenergiereeePtorkinasesubfamily(GRKZand3)and(3)theGRK4subfamily(GRK4，5and6).GRKS，oneofthernosteharaeterizedmembers，15widelydistributedinavarietyoforgans，esPeciallyhighexPressioninthehealtandlung，andPlaysimPortantroleinregulatingavarietyofP

7、hysiologiealandPathologiealProeesses.PreviousresearehesaboutGRKsmainlyfoeusedonthematurelydeveloPedorgans.Metayeetal.observedaninereaseinGRKZactivityandasignifieantdeereaseinGRKSeXPressionindifferentiatedthyroidearcinoma(DTC).知oekdownGRKSinosteosareomaeellsinL