通过crisprcas9系统编辑斑马鱼hoxb4基因及其突变体基因型的初筛

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1、《中国图书资料分类法Y#养号:其394.3.UDC：602,..；■''■':学科专业彳t码:1G0202’，《,'*'yt■二.£-»_贵阳.医学、院，2015届硕i学位论文(科学学位）一通过CRISPR/Cas9系纟充编辑斑马鱼/zarZ?¥基因及其突变体基因型的初筛GenomeeditingofzebrafishTzoxZ?^geneusingCRISPR/Cas9systemanditsmutantscreening究生:袁梦师:何志旭教授级：2G12级'华：:二〇一五年五月.贵阳医学院学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下

2、，独立进行研究工作所取得的成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何甚他个人或集体己经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出更要页献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。除与外单位合作项目将予以明确方式规定外，本研究己发表与未发表成果的知识产权均归属贵阳医学院。本人完全意识到本声明的法律后果由本人求担。从丨c年y月q曰2^r年t月w曰学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权贵阳医学院可以将本学位论文的全部或部分内容编

3、入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于（请在以下相应方框内打“）：1、保密□，在_年解密后适用本授权书。2、不保密W。7_0斤年r月>7曰M's年i：月曰《中国图书资料分类法》分类号：R394.3单位代码：10660UDC：602学号：10660S120200学科专业代码：100202密级：公开贵阳医学院2015届硕士学位论文（科学学位）通过CRISPR/Cas9系统编辑斑马鱼hoxb4基因及其突变体基因型的初筛Genomeeditingofzebrafishhoxb4geneusingCRISPR/Ca

4、s9systemanditsmutantscreening论文作者：袁梦指导教师：何志旭教授申请学位：医学硕士培养单位：临床医学院学科专业：儿科学研究方向：干细胞应用基础及血液病研究起止日期：2014年10月至2015年10月论文评阅人：盲评答辩委员会主席：项鹏教授论文答辩日期：2015年5月23日二〇一五年五月通过CRISPR/Cas9系统编辑斑马鱼hoxb4基因及其突变体基因型的初筛专业：儿科学硕士研究生：袁梦导师：何志旭教授【摘要】目的：造血干细胞是一群具有高度的自我复制及多项分化潜能的最原始的造血细胞。人类HOXB4基因编码一类具有同源盒DNA依赖的

5、结构域核蛋白，在造血干细胞的自我更新和分化过程中起到重要的调控作用。如何在体外扩增造血干细胞，使其既能保留其自我更新的特征又可以向不同血细胞分化是目前研究的重点和难点，调控其增殖和分化的因素和机制尚不明了，本课题采用高效基因编辑系统CRISPR/Cas9在基因组水平对斑马鱼的hoxb4基因进行编辑，并对其进行阳性突变体的筛选，以期建立下调hoxb4基因的突变体斑马鱼模型，为进一步筛选其下游靶基因及探讨对造血系统的作用机制提供实验材料及理论依据。方法：根据hoxb4基因的一号外显子的正义链及反义链设计3个长约20bp###的gRNA，分别靶向ExonI的192

6、位点，244位点及313位点。化学合成gRNA(guideRNA)寡核苷酸序列，经过酶切克隆连入pT7-gRNA质粒中，构建gRNA的体外转录载体并通过体外转录得到靶位点的gRNA。将质粒pSP6-2sNLS-spCas9线性化后经体外转录得到Cas9的mRNA并进行添加A尾修饰，将以上靶位点的gRNA与Cas9的mRNA共注射入单细胞期的斑马鱼胚胎内，提取靶序列基因组DNA，PCR扩增出靶序列并使用T7EI酶切测效，最后将PCR产物连入pMD19-Tsimple载体中，挑取阳性克隆进行菌落PCR鉴定，然后经Sanger测序检测突变类型。结果：1.hoxb4

7、靶序列基因组DNA的核酸扩增产物经测序鉴定结果与预期相符；2.设计的敲除hoxb4靶点的gRNA寡核苷酸双链成功连入pT7-gRNA质粒中且经碱基序列鉴定与预期相符；3.靶向hoxb4基因一号#外显子的313位点的gRNA成功编辑斑马鱼hoxb4基因，经T7EI酶切检测其敲#除效率高达26.5%；4.313靶序列的核酸扩增产物成功连入pMD19-Tsimple载体中并经测序筛选得到4种阳性突变型；5.有30%的斑马鱼可看到心包增大、心腔壁变薄及血流减缓血细胞减少的表现。结论：1.作为同源盒基因的hoxb4基因其表达可能在一定程度上呈现功能冗余性，即一个基因的

8、异常可以被另一个基因的功能来补偿而不致引发疾病；2.