采用斑马鱼建立可诱导显性突变体筛选体系

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1、万方数据分类号：Q29密级：垒珏中文论文题目：洳≥j≥～暗博士学位论文⑧单位代码：10335学号：11307010丕英文论文题目：Induciblesystemfordominantmutantscreeninp■l一’inzeDraJJsh__●●_●__●____●_____●●-__●-_●●●__●l一申请人姓名：呈圭鹏指导教师：医至专业名称：生物堂研究方向：筮直生物堂所在学院：生金型堂堂瞳论文提交日期——2016．09⑧万方数据IIIIIllUIIIllUllUUlIIIIJXJIIJY311335论文作者签名：要圭!吐指导教师签名：论

2、文评阅人1：评阅人2：评阅人3：评阅人4：评阅人5：答辩委员会主席：杨里至塾拯生金型堂堂院委员1：彭金苤数援动物型堂堂院委员2：星珏麴握生金抖堂堂院委员3：全复主熬援生金型堂堂陵委员4：医茎复麴拯生金抖堂堂院委员5-陵至塾拯生金型堂堂院答辩日期：2016．09．】2万方数据Author’ssignature：一‘■‘Supervisor7ssignature：ExtemalReviewers：ExaminingCommitteeChairperson：Dateoforaldefence：2016．09．12地燃黜糊糊幽万方数据浙江大学研究生学位论

3、文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得堂望盘鲎或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。⋯一虢马志鹏黼期铷毛年垌日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解逝姿态鲎有权保留并向国家有关部门或机构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝姿态堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影

4、印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：马志、鹇签字隰如儿年气月刁日导师签名：签字日期：Z矽1忌年(?月滩f．f万方数据摘要传统的正向遗传筛选主要包括辐射诱变，化学诱变和DNA插入诱变等基因突变方法。这几种诱变方法所产生的绝大多数突变会让基因丧失全部或部分功能，极少情况下产生功能获得性突变。正向遗传筛选已在揭示各种生命复杂过程的分子机制中起着重要的作用。但它还有一定的局限性，如：这些诱变方法所产生的突变体一般为隐性突变，所以需要经过三代才获得纯合突变体，占用空间，耗费时间，消耗劳动力；其

5、次，基因的异位表达同样对基因功能研究非常重要，这也是传统筛选体系所缺乏的；特别是，很多基因在胚胎发育中起重要的作用，纯合突变体早期胚胎致死，因此不能利用这些突变体研究其基因在成体各种过程中的功能，如：器官再生，行为产生等。由于传统正向遗传筛选的这些缺陷，急需建立新的遗传筛选体系。斑马鱼不仅由于养殖方便，繁殖周期短，产卵量大，体外受精，体外发育，胚胎透明等，已经广泛应用于早期胚胎发育研究，并且由于它的大多数器官如：尾鳍，心脏，肝脏，侧线，脊椎等都能再生，所以越来越多的科学家利用斑马鱼来研究器官再生分子机制。化学诱变和DNA插入诱变等正向遗传筛选方法

6、的建立让斑马鱼成为很好的遗传模式体系。本项研究将利用斑马鱼构建可诱导显性突变体筛选体系。新的筛选体系既可用来在F1代胚胎期筛选早期发育缺陷突变体，也可用来筛选F1代成鱼尾鳍再生缺陷突变体。其基本原理为：T012介导的Tet-on启动子随机插入斑马鱼的基因组，当Tet—on启动子正向插入某个基因的5’端，在四环素处理下，此目标基因将会被过量表达：当Tet—Orl启动子反向插入某个基因的内部时，在四环素处理下，此目标基因的反义RNA将会被激活表达，目标基因将会被敲低。从700个F0斑马鱼中，我们筛选到了300个转基因系，在此300个转基因系的中，我们

7、共筛选到了27个突变体，其中20个突变体仅呈现早期胚胎发育缺陷，3个突变体仅首先呈现尾鳍缺陷，4个突变体呈现两种缺陷。在此27个突变体中，共鉴定出58个基因其中包括8个非编码基因，在四环素处理下，大部分基因被诱导敲低，少部分基因被诱导过量表达。此58个基因其中包括一些已知的基因如：角订，grbl4，pcytlaa，nidogen2，sgcd,ap2bl等，这些基因突变体在胚胎期的表型与已发表研究结果类似。我们研究证明可诱导显性突变体筛选体系是一个非常有效的遗传筛选体系。综上所述，本课题建立了一种新型的遗传筛选体系，特别适用于成体突变体的筛选，万方

8、数据摘要是对传统筛选体系的很好补充。此外，该系统还可以应用于其他物种，特别是小鼠的正向遗传筛选，因为小鼠的传统正向遗传筛选，需要大量的空