绵羊rad51基因的克隆与真核表达

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1、分类号：密级：学号：2012108031单位代码：10759石河子大学碩士#住铪夂绵羊Rad51基因的克隆与真核表达学位申请人___________杨娇指导教师何高明___________皮文辉____________周平申请学位门类级别农学硕士学科、专业名称临床兽医学研究方向动物临床疾病所在学院动物科技学院中国•新疆•石河子2015年6月分类号：密级：学号：2012108031单位代码：10759石河子大学硕士学位论文绵羊Rad51基因的克隆与真核表达学位申请人杨娇指导教师何高明皮文辉周平申请学位门类级别农学硕士

2、学科、专业名称临床兽医学研究方向动物临床疾病所在学院动物科技学院中国·新疆·石河子2015年6月CloneandeukaryoticexpressionRad51geneinovisariesADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofAgricultureByYangJiao(ClinicalVeterinaryMedicine)DissertationSup

3、ervisor:Prof.HeGao-mingDr.PiWen-huiDr.ZhouPingJune,2015本研究受国家转基因重大专项——优质转基因肉羊新品种培育（项目编号：2014ZX08008-003）资助。ThisresearchissupportedbytheNationalTransgenicMajorProgramnamedbyThehighqualityoftransgenicmuttonsheep。(NO.2014ZX08008-003).摘要Rad51基因可以介导同源重组修复，有助于维持基因组的

4、稳定性，抵御细胞毒性因子对DNA造成损害。本研究通过建立绵羊Rad51基因表达载体，并在绵羊成纤维细胞中表达Rad51蛋白，对比致使同一基因DNA双链断裂的不同质粒转染到绵羊成纤维细胞中Rad51基因的表达情况，探讨Rad51基因真核表达用于克隆和提高同源重组效率，为提高绵羊成纤维细胞阳性单克隆数量奠定理论和试验基础。方法：试验一：选择18月龄萨福克母羊耳缘皮肤组织，采用Ⅳ胶原酶和胰TM酶替代物（TrypLESelect）两种混合酶消化法对耳缘成纤维细胞进行原代培养、细胞传代、冻存、复苏，以期获得高纯度的绵羊成纤维

5、细胞。试验二：设计绵羊Rad51基因cDNAPCR引物并进行反转录PCR，产物插入到带有AflⅡ和XhoⅠ酶切位点的pcDNA3.1（+）构建真核表达载体pcDNA3.1-Rad51，并用PCR、酶切、测序进行鉴定。试验三：选择100μL电转杯、CZ-167程序将4μgRad51表6达载体、作用于MSTN的CRISPR/Cas9质粒和TALENs质粒分别导入到2×10个绵羊成纤维细胞，同时以pMAX空载体为对照检测质粒在细胞中表达情况。试验四：采用实时荧光定量PCR（QuantitativeReal-timePCR

6、）和蛋白免疫杂交（WesternBlot）对经电转染质粒的成纤维细胞Rad51基因在mRNA和蛋白水平的表达进行检测，试验数据用LSD统计方法进行分析。结果：试验一结果显示：通过两步酶消化法结合差速贴壁法可以获得高纯度的绵羊成纤维细胞，该细胞贴壁后呈长梭形，生长状况良好（2天可以长满60mm细胞培养皿）。试验二结果显示：设计的PCR引物从绵羊基因组扩增获得Rad51基因cDNA片段，将绵羊Rad51基因序列测序结果与NCBI公布序列比对，发现从ATG起始密码子开始，第90位碱基发生替代：A-G（NCBI是G）。氨基

7、酸分析显示第90位碱基替代并未改变氨基酸，改变后的密码子与NCBI公布的密码子为同义密码子，其余部分序列完全一致，成功构建绵羊Rad51真核表达载体。试验三结果显示：成纤维细胞转染pMAX质粒72h发现大量绿色荧光蛋白，且细胞在6孔板中的汇合度能达到80%以上。试验四结果显示：DNA双链断裂，Rad51基因在mRNA水平表达量极显著高于正常细胞，蛋白质表达量于正常细胞相比差异极显著；不同的DNA断裂方式，Rad51基因的表达量亦不尽相同。结论：以pcDNA3.1（+）为骨架，插入扩增的绵羊Rad51基因cDNA成功

8、构建绵羊Rad51真核表达载体；经电转染CRISPR/Cas9、TALENs、pcDNA3.1-Rad51、pMAX质粒的成纤维细胞Rad51mRNA和蛋白质表达极显著高于与绵羊正常成纤维细胞量。关键词：绵羊成纤维细胞；Rad51；同源重组；电转染IAbstractGeneofRad51canleadthehomologousrecombinationrep