猪瘟病毒ns5a蛋白与hsp70的相互作用及引起细胞未折叠蛋白反应

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1、分类号：S885.3学校代码：10712UDC：636.09研究生学号：2012060156密级：公开2015届攻读博士学位研究生学位（毕业）论文猪瘟病毒NS5A蛋白与HSP70的相互作用及引起细胞未折叠蛋白反应学科专业预防兽医学研究方向分子病原学与免疫学研究生张成成指导教师张彦明教授完成时间2015年6月中国陕西杨凌Classificationcode:S885.3Universitycode:10712UDC:636.09Postgraduatenumber:2012060156Confidentialitylevel:OpenThesisforP

2、h.D’sDegreeNorthwestA＆FUniversityin2015NS5AProteinofClassicalSwineFeverVirusInteracteswithHostCellsHSP70andInducetheUnfoldedProteinResponseMajor:preventiveveterinaryResearchfield:MolecularetiologyandimmunologyNameofPostgraduate:ZhangchengchengAdviser:ProfessorZhangYanmingDateofs

3、ubmission:June，2015YanglingShaanxiChina本研究由国家自然科学基金项目（31172339）提供资助ThisworksupportedbygrantfromNationalNaturalScienceFoundationofChina（31172339）猪瘟病毒NS5A蛋白与HSP70的相互作用及引起细胞未折叠蛋白反应摘要猪瘟（Classicalswinefever，CSF）是由猪瘟病毒（Classicalswinefevervirus，CSFV）引起的一种以高热、全身性出血和免疫抑制为主要特征的猪的烈性传染病。该病具

4、有传播快、致死率高，不同年龄段和品种的猪均可感染，被世界动物卫生组织（OIE）列为必须报告的动物传染病之一，我国也将其列为一类动物疫病。CSFV为有囊膜的单股正链RNA病毒，属于黄病毒科瘟病毒属成员。NS5A蛋白是其8个非结构蛋白之一，也是病毒复制复合体的重要组成部分。本研究围绕CSFVNS5A蛋白，主要研究其与宿主细胞HSP70的相互作用进而对病毒自身复制的影响，以及NS5A蛋白激活宿主细胞未折叠蛋白反应（Unfoldedproteinresponse，UPR）的信号通路机制，获得了以下结果。1.CSFVNS5A蛋白与宿主HSP70蛋白存在相互作用。

5、在蛋白水平，分别利用Co-IP及GST-Pulldown技术在细胞内和细胞外分别验证NS5A及HSP70能够相互结合，并且通过Co-IP方法证明是NS5A蛋白的N端氨基酸负责与HSP70的相互作用；在细胞水平，用激光共聚焦技术证明两种蛋白在细胞中存在共定位现象。2.HSP70蛋白能促进CSFV基因复制。由于NS5A蛋白是CSFV复制复合体的组成部分之一，参与病毒基因的复制。在已经证明NS5A与HSP70存在相互作用的基础上，利用不同过表达方法实现对HSP70在细胞中的过表达，以及用慢病毒介导shRNA和用HSP70蛋白特异性抑制剂槲皮素的方法对HSP7

6、0基因进行沉默以降低细胞中HSP70表达量，结果均表明HSP70在细胞中的表达量与CSFV基因复制量呈现一定的正相关关系，即HSP70蛋白对CSFV基因复制起着明显的促进作用。值得强调的是我们发现，在CSFV感染的ST细胞中，HSP70的表达量也呈现明显的上升趋势，说明CSFV自身也能上调HSP70表达，其目的应该是利于病毒本身的增殖。3.CSFV感染ST细胞或在ST细胞中外源表达NS5A蛋白都能诱发细胞发生未折叠蛋白反应（UPR），且激活UPR的信号通路一致，均激活ATF6和IRE1途径，对PERK途径影响较小。在UPR通路中，ATF6及IRE1信号

7、途径的激活均有助于细胞对于未折叠或错误折叠蛋白的重新折叠或降解，达到缓解内质网应激、维持细胞稳态的效果；而PERK途径后期将诱发细胞发生细胞凋亡。用qRT-PCR及Westernblot方法分别在基因和蛋白水平研究CSFV及NS5A蛋白对细胞UPR信号通路中关键蛋白表达情况影响，证实其诱发UPR的信号通路机制是通过激活ATF6及IRE1途径实现的。4.用点突变方法研究证实NS5A蛋白的第81位丝氨酸和第401位苏氨酸是其激活UPR通路的关键氨基酸位点。相比于正常NS5A蛋白，当其第81位丝氨酸和第401位苏氨酸被丙氨酸定点替换后，其上调UPR通路中AT

8、F6和GRP78分子表达能力消失。综上所述，CSFVNS5A蛋白既能通过与宿主细胞HSP70蛋