棉花ghwrky44和ghwrky22基因的克隆及功能初步分析

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1、分类号：密级：公开学号：2012107008单位代码：10759石河子大学硕士学位论文棉花GhWRKY44和GhWRKY22基因的克隆及功能初步分析学位申请人赵曾强指导教师张薇教授申请学位门类级别农学硕士学科、专业名称作物遗传育种研究方向作物分子育种所在学院农学院中国·新疆·石河子2015年6月CloningandfunctionalanalysisofGhWRKY44andGhWRKY22geneincottonADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillmentoftheRe

2、quirementsfortheDegreeofMasterofAgricultureByZhaoZeng-qiang(CropGeneticBreeding)DissertationSupervisor:Prof.ZhangWeiJune,2015摘要目的：棉花枯萎病是影响海岛棉产量和品质的最重要的病害，由于海岛棉中缺乏高抗枯萎病的资源，因此从枯萎病抗性资源丰富的陆地棉中克隆抗病相关基因，利用转基因技术改良海岛棉抗病性是解决海岛棉枯萎病的有效途径，而植物转录因子在抗病信号途径中处于枢纽地位，如WRKY转录因子具有高度保守的DNA结合域——WRKY

3、结构域，即在病原物、化学物质或外界损伤的诱导条件下，WRKY蛋白的WRKY结构域能专一地识别并结合目的基因上游启动子中的W-box序列（C/TTGACT/C），调控下游基因如病程相关蛋白基因的转录过程，从而改变植物抗病、抗逆性状，在植物抵抗生物和非生物胁迫中扮演重要角色。本研究以枯萎病菌诱导棉花根部基因表达谱中筛选得到WRKY基因片段为探针，结合生物信息学方法，从陆地棉中克隆抗枯萎病相关的WRKY转录因子，并初步研究其功能，为海岛棉抗枯萎病分子育种奠定基础。方法：本研究以高抗枯萎病的陆地棉“中棉所12”为实验材料，以枯萎病菌诱导棉花根部基因表达谱中

4、筛选得到WRKY基因片段为探针，利用电子克隆结合RT-PCR技术，从陆地棉“中棉所12”根部cDNA中克隆与抗枯萎病相关WRKY转录因子基因GhWRKY44、GhWRKY22；利用qRT-PCR技术分析GhWRKY44、GhWRKY22基因在棉花枯萎病菌、ET、SA和JA胁迫下的表达模式；构建GhWRKY44、GhWRKY22基因的植物过表达载体，利用农杆菌介导法和农杆菌侵染花柱头法分别转化烟草和海岛棉，初步研究基因的功能。结果：1.从抗枯萎病的陆地棉品种“中棉所12”中克隆了2个抗枯萎病相关的WRKY转录因子基因GhWRKY44（登录号：KJ80

5、1807）与GhWRKY22（登录号：KJ801808）。GhWRKY44的开放阅读框为1197bp，编码398个氨基酸，编码的氨基酸中含有两个典型的WRKY结构域，锌指结构为C2H2型，属于WRKY家族I类；GhWRKY22的开放阅读框为686bp，编码228个氨基酸，氨基酸中含有一个典型的WRKY结构域，锌指结构为CX4-5CX22-23HX1H（X为任意氨基酸），同源分析表明，该基因属于WRKY家族II类e亚族。2.利用生物信息学软件对GhWRKY44和GhWRKY22基因编码的蛋白质理化性质分析表明，GhWRKY44基因编码的蛋白分子量为4

6、4.24kD，理论等电点为8.80，为亲水蛋白，GhWRKY22基因编码的蛋白分子量为25.47kD，理论等电点为9.65，为亲水蛋白。GhWRKY44和GhWRKY22基因编码的蛋白质无规则卷曲是该蛋白二级结构的主要组成元件，均存在核定位信号序列（KRKK/KRRK），核定位预测分析该基因可能位于细胞核中。3.qRT-PCR分析发现：感病品种与抗病品种经棉花枯萎病菌诱导后，GhWRKY44和GhWRKY22基因在抗病品种中的表达量明显高于感病品种，对于病原菌的响应时间要早于感病品种。分别用SA、JA和ET处理抗病品种“中棉所12”棉苗后，ET处理

7、后，GhWRKY44和GhWRKY22基因的表达量变化不明显，SA和JA均能够诱导GhWRKY44和GhWRKY22基因的表达。SA处理后，GhWRKY44基因的表达量迅速增加，随处理后时间的推移，其表达量一直维持在一个较高的水平，处理后24h表达量达到最高；JA处理后，该基因的表达量呈现先增加后降低的变化趋势，处理后4h其表达量I达到最高值，但其表达水平明显低于SA处理。JA与SA处理后，GhWRKY22基因呈现先升高然后下降的趋势，相对处理前也有明显变化，随时间的延长，JA与SA1h表达量最高；但二者在7个处理时间点的平均相对表达量相差不大。4

8、.构建基因（GhWRKY44和GhWRKY22）植物过表达载体，通过农杆菌介导法将目的基因转入烟草，从两个转基因后代各选取