棉花抗枯萎病相关GhERF5基因的克隆及功能初步分析.pdf

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1、分类号：密级：三年学号：2015201217单位代码：10759石河子大学硕士学位论文棉花抗枯萎病相关GhERF5基因的克隆及功能初步分析学位申请人郭文婷指导教师张薇教授申请学位门类级别农学硕士学科、专业名称作物遗传育种研究方向作物分子育种所在学院农学院中国·新疆·石河子2018年6月IsolationandAnalysisofGhERF5GenesRelatedtoDisease-resistanceinCottonADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirem

2、entsfortheDegreeofMasterofAgricultureByGuoWen-ting(CropGeneticBreeding)DissertationSupervisor:Prof.ZhangWeiJune,2018石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意。研究生签名：时间：年月日使用授权声明本人完全了解

3、石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文在学校图书馆保存并允许被查阅。有权自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提供检索服务。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日摘要目的：棉花枯萎病是海岛棉（GossypiumbarbadenseL.）最致命的真菌性病害之一，严重降低了海岛棉的质量和产量。因此，运用分子生物学技术，研究及筛选棉花的抗枯萎病基因对选育新的抗病品种是极其必要的。ERF转录因子可以启动下游通

4、路中抗病相关基因的表达，进而调节植物对病原菌的抗性。本研究从陆地棉中克隆GhERF5基因，并分析其功能，为海岛棉抗病分子育种提供新的基因资源。方法：利用电子克隆技术以及RT-PCR方法得到4个GhERF5基因，通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法分析其在枯萎病菌及不同激素处理时的表达模式；在烟草（Nicotianatabacum）中过表达GhERF5-4D基因研究其功能；利用VIGS技术分析GhERF5-4D基因在棉花抗病过程中的作用。结果：1、通过电子克隆技术，并结合对棉花TM-1数据库中基因的分析，克隆得到4个GhERF5基因，分别为GhERF5-1D

5、(登录号：MF145657)、GhERF5-2A(登录号：MG693187)、GhERF5-3A(登录号：MF197875)和GhERF5-4D（登录号：MF093148），其中GhERF5-1D和GhERF5-4D来自D基因组；GhERF5-2A和GhERF5-3A来自A基因组。编码区分别为990bp、711bp、672bp和663bp，分别编码329、236、223和220个氨基酸。生物信息学分析结果显示：四个基因编码的蛋白都为亲水蛋白，且这四个蛋白都含有不同数目的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化位点。对其蛋白质进行二级结构分析表明，这四个基因编码的氨基酸都含有α

6、-螺旋结构和β折叠。2、对GhERF5-1D、GhERF5-2A、GhERF5-3A和GhERF5-4D基因表达模式进行分析，结果显示，不同基因，其表达模式也不同。枯萎病菌处理后，GhERF5-4D和GhERF5-1D基因在抗病品种‘中棉所12’中呈上调表达，在感病品种‘新陆早7号’中呈下调表达。GhERF5-2A在‘中棉所12’中呈下调表达，在‘新陆早7号’中呈上调表达。GhERF5-3A基因在‘中棉所12’和‘新陆早7号’都呈上调表达。GhERF5-4D和GhERF5-3A在ET和MeJA处理后，其相对表达量明显增加，呈上调表达，SA处理后呈下调表达。GhER

7、F5-1D、GhERF5-2A在ET、MeJA和SA处理后都呈上调表达。3、构建GhERF5-4D基因的过表达载体，利用农杆菌介导法转化烟草，经卡那霉素筛选和PCR鉴定，获得20株T1代阳性植株。对T1代阳性植株接菌后分析其抗病相关基因的表达，与野生型烟草相比，转GhERF5-4D基因的过表达株系中，PR1、PR2、PR5和ERF1的相对表达量均高于野生型株系，其中PR1基因在转基因株系中的表达是野生型中的5倍，PR5基因在转基因株系中的表达是野生型中的5.8倍；WRKY70的相对表达量低于野生型株系，仅为野生型株系中的35%；PR4和CHI-B的相对表达量和野生

8、型相比变化