棉花GhFAD2基因的克隆及功能分析.pdf

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1、I分类号：密级：学号：2014107018单位代码：10759石河子大学硕士学位论文棉花GhFAD2基因的克隆及功能分析学位申请人文凤指导教师孙杰（教授）刘峰（副教授）申请学位门类级别农学硕士学科、专业名称作物遗传育种研究方向作物分子育种所在学院农学院中国·新疆·石河子2018年5月IICloningandfunctionanalysisofΔ-12fattyaciddesaturasesGhFAD2geneinuplandCotton(GossypiumhirsutumL.)ADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfi

2、llmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofAgricultureByWenFeng(CropGeneticsandBreeding)DissertationSupervisor:Prof.SunJieA.Prof.LiuFengMay,2018III石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意。研究

3、生签名：时间：年月日使用授权声明本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文在学校图书馆保存并允许被查阅。有权自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提供检索服务。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日IV摘要目的：在植物脂肪酸合成代谢过程中，Δ12脂肪酸去饱和酶基因FAD2是控制油酸脱氢合成亚油酸的关键酶基因。在油料作物中，油酸（C18:1）和亚油酸（C18:2）是种子油脂中的主要脂肪酸组分，其在油料作物种子中的相对

4、比例决定了食用植物油的营养价值与氧化稳定性。棉花既是最重要的纤维作物，又是重要的油料作物。克隆棉籽中特异高效表达的FAD2基因，并对其深入研究，有利于采用脂肪酸代谢基因工程技术对棉仁中脂肪酸成分进行定向修饰和改造。方法：（1）在已知GhFAD2氨基酸序列（GenBankX97016）的基础上，从棉花基因组数据库中电子克隆获得GhFAD2家族基因，并对其进行生物信息学分析；（2）利用qRT-PCR技术分析GhFAD2基因家族在棉花不同组织和种子不同发育时期中的表达特性；（3）利用索氏提取法（石油醚法）提取不同发育时期棉籽中的总油脂，并通过GC-MS测定花后5-60天（DPA）的12个不同

5、发育阶段棉籽的样品，分析棉籽中特异高效表达的GhFAD2在棉籽不同发育时期中mRNA表达水平与C18:1/C18:2比值；（4）用波通近红外扫描仪无损伤测定566份陆地棉品种（系），筛选出高（>20%）、中（17%-19%）、低（11%-16%）油份的棉花材料，进而测定其各脂肪酸组分的相对含量，分析GhFAD2表达水平（油酸/亚油酸的相对比例）与棉籽的油脂含量的相关性。（5）通过同源技术克隆获得棉籽中特异高效表达的GhFAD2-1，利用Gateway技术构建35HK-GhFAD2-1植物干扰表达载体，用DNA重组技术构建pBI121-GhFAD2-1植物超表达载体，分别转化模式植物拟南

6、芥和新陆早33号，分析GhFAD2-1的功能。结果与结论：1.利用生物信息学方法，从棉花基因组数据库中电子克隆获得GhFAD2家族基因。GhFAD2基因在A基因组和D基因组中均有4个拷贝，分别命名为GhFAD2-1A、GhFAD2-1D、GhFAD2-2A、GhFAD2-2D、GhFAD2-3A、GhFAD2-3D、GhFAD2-4A、GhFAD2-4D。通过序列分析可知，GhFAD2基因编码区连续均无内含子序列，棉花的同一FAD2基因在A基因组与D基因组的序列高度一致。2.qRT-PCR结果表明，GhFAD2-1/2/3/4基因在不同组织中都存在差异，GhFAD2-1基因在发育中的种

7、子中特异高效表达,而在其它组织中表达量很低。GhFAD2-2基因在陆地棉各组织中都有表达，但表达量很低。GhFAD2-3和GhFAD2-4基因同源性高达98.44%，在所有组织中均有表达，包括根、茎、叶片、花和种子。3.利用qRT-PCR技术分析发现GhFAD2-1基因在棉籽发育呈先升高后降低的趋势，40DPA是其表达峰值。使用GC-MS气相色谱-质谱联用仪测定其脂肪酸组成，结果分析表明油酸/亚油酸比值与FAD2-1基因表达呈负相关。通过对陆地