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分类号：S562单位代码：10758密级：公开学号：09010004博士学位论文海岛棉枯萎病抗性相关基因的克隆及功能验证FusariumWiltResistanceRelated-geneCloningandFunctionalAnalysisofGossypiumbarbadenseL.研究生：刘艳指导教师：曲延英申请学位门类级别：农学博士专业名称：作物遗传育种研究方向：棉花遗传育种所在学院：农学院新疆·乌鲁木齐二○一三年六月 独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得新疆农业大学或其他教育单位的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：时间：年月日关于学位论文使用授权的说明本人完全了解新疆农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：新疆农业大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，允许论文被查阅和借阅。本人授权新疆农业大学将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以公布（包括刊登）论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日 本文是国家自然科学基金项目“海岛棉高密度遗传连锁图谱构建及抗病标记辅助选择效应评价”的部分研究成果（项目编号：31260361）课题主持人：曲延英教授（新疆农业大学） 海岛棉枯萎病抗性相关基因的克隆及功能验证摘要新疆是中国唯一的海岛棉种植基地。海岛棉比起陆地棉有着纤维长度、比强度、细度等方面优异的特性，是纺高支纱必不可缺少的原料，在国民经济中具有举足轻重的地位。然而海岛棉枯萎病的蔓延严重制约着其生产，影响了棉农种植海岛棉的积极性，使新疆海岛棉种植面积及产量都大幅度下降。棉花抗病新品种的选育和种植是解决这个难题的有效途径之一。培育抗病棉花新品种的关键是要研究海岛棉抗枯萎病的机理机抗病相关基因的作用，从而在分子水平上对海岛棉加以改良，获得具有高抗特性的棉花新品种。本研究首先以定位到的与海岛棉枯萎病抗性基因紧密连锁的分子标记为基础，通过对功能标记位点的克隆，获得抗性相关基因的全序列；利用RT-PCR研究该基因的表达特性，并通过转化烟草进一步揭示该基因在枯萎病抗性中的作用，结果如下：1.根据GenBank数据库上公布的抗病基因序列，设计出107对RGA引物，利用高抗枯萎病的海岛棉品系“06-146”、高感枯萎病的海岛棉品种新海14号及以杂交F2群体中随机选取的180个单株为实验材料，利用RGA引物在亲本间筛选出来的12对引物在抗、感基因池中进行筛选，初步确定Gbrga14是与海岛棉枯萎病紧密连锁的分子标记，该分子标记与海岛棉枯萎病抗性的交换值为15.5%，与海岛棉抗枯萎病基因的遗传距离为15.92cM。查找连锁标记的来源发现，根据拟南芥RPP5基因设计的引物最多，有4对（占33.33%）。这12对具有多态性的RGA标记主要由3类组成，其中TIR-NBS-LRR类6对，占50%；NBS-LRR类5对，占41.67%；NBS类1对，占8.33%。2.通过对Gbrga14在两亲本间扩增出来的位点进行回收测序，以该测序片段为探针，通过同源克隆的方法，分别克隆到两条抗性相关基因，命名为RGBCH和SGBCH。BLAST比对分析显示，RGBCH、SGBCH基因具有较高的基因多态性。生物信息学分析表明，α-螺旋均是两个蛋白二级结构的主要部分。ProtFunI 预测RGBCH蛋白的主要功能是参与能量代谢和生物合成辅助因子；SGBCH蛋白的主要功能是参与蛋白质翻译过程中的能量转换。3.选取5份不同的海岛棉及陆地棉材料，经枯萎病诱导后，取不同的组织器官分别进行荧光定量PCR检测。利用特异性引物GBCH–Q对材料的荧光定量PCR分析可知：品系“06-146”目的基因在不同组织器官的表达量在4d达到峰值；新海14号目的基因在6d时出现一个最高值，随后降低到最初水平；中棉所35号、军棉1号和TM-1在诱导前和诱导后表达量均很微弱或者比较一致，基本维持在低水平表达；利用引物StVe-Q对材料的荧光定量PCR分析可知：品系“06-146”、新海14号、中棉所35号、军棉1号和TM-1的目的基因在病菌诱导条件下，没有随着诱导时间的变化而呈现表达变化状态。说明已克隆的RGBCH和SGBCH只在海岛棉材料中表达，是与枯萎病抗性相关的两个基因。4.将RGBCH、SGBCH基因重组到pCAMBIA1301植物表达载体上，构建了海岛棉pCAMBIA1301-RGBCH、pCAMBIA1301-SGBCH的植物表达载体，同时利用农杆菌介导的方法将RGBCH、SGBCH基因整合到烟草基因组中，并获得T1代种子。对T1代转基因及非转基因烟草采用菌液浇根法（每种材料种植30株），转RGBCH基因植株的存活率为78%，叶片呈显黄化状态，，而转SGBCH基因大部分的叶片干枯直至死亡，植株的存活率为24%，非转基因植株几乎全部死亡。研究表明转RGBCH基因的转入提高了烟草的抗枯萎病病菌的能力。关键词：海岛棉；Fusarinmwilt；连锁标记；荧光定量PCR；功能验证II FusariumWiltresistancerelated-genecloningandfunctionalanalysisofGossypiumbarbadenseL.AbstractCottonisthemaincashcrops,whichhasapivotalpositioninthenationaleconomy.Xinjiangcottondistrict,asthemainrawcottonproductionbase,whichhasanimportantroleinthewholecountry.FusariumWiltisoneofthemaindiseasesofseriousharmtothecottonproduction,breedingandplantingnewdisease-resistantvarietiesofcottonisthemostcost-effectiveonlywaytosolvethisproblem.Usingtraditionalbreedingmethodstocultivatethenewvarietiesneedstoolongcycle,anditisunabletomeettheurgentneedoftheproduction,socloningofresistancegeneandstudyingofthegeneexpressionhavegreatsignificanceinbreedingfordiseaseresistance.Inthisstudy,resistancetoFusariumwiltresistancetosea-islandcottontightlylinkedmolecularmarkerssites,obtainingthesequenceofresistancerelatedgenes;AndthenusingtheprocessofFusariumWiltpathogeninfectionofcottonresultingintheonset,inordertocleartheabovegeneexpressionlevel,furthertoexplaintheroleofthisgeneinresistancetoFusariumWilt.Theresultsareasfollows:1.ResistancegenesequencepublishedintheGenBankdatabase,designed107pairstheRGAprimers,theuseofhighresistancetoFusariumwiltIslandCotton“06-146”highlysusceptibletoFusariumwiltIslandCottonXinhai14andmiscellaneoushomeF2groupsrandomlyselect180plantmaterials,useofRGAprimermaterialbetweenparentscreeningout12pairsofprimersmatterscreeninganti,sensegenepool,preliminarytodetermineGbrga14islandcottonwiltdiseasecloselylinkedtothemolecularmarkers,molecularmarkersandtheSeaIslandcottonwiltdiseaseresistanceexchangevalueswere15.5%,andSeaIslandcottonresistancetoFusariumwiltgenegeneticdistanceto15.92cm.Findingthesourceofthelinkedmarkersfound,accordingtotheprimersoftheArabidopsisthalianatheRPP5genedesign,4(33.33%).This12pairsofpolymorphicRGAmarkersmainlycomposedofthreeclasses,whichTIR-NBS-LRRclassofsixpairs,accountingfor50%;NBS-LRRclassoffivepairs,accountingfor41.67%;NBSclass1pair,accountingfor8.33%.2.ThethroughonforrecyclingGbrga14lociamplificationbetweenthetwoparentalsequencing,thesequencingfragmentasaprobe,bymeansofsilicocloningmethod,obtainingtwodisease-resistantgene,namedintoRGBCHandSGBCH,BLASTalignmentanalysisshowedthatRGBCH、SGBCHpossessahighgeneticpolymorphism.Bioinformaticsanalysisshowedthattheα-helixisthemainpartofthesecondarystructureofthetwoproteins.ProtFunforecastedthemainfunctionoftheRGBCHproteinisparticipatingenergymetabolismandbiosynthesizingcofactors;ThemainfunctionoftheSGBCHproteinisparticipatingenergyconversionintheprocessofproteintranslation.3.InducedbyFusariumoxysporumfivedifferentmaterialsindifferenttissuesandIII fluorescencequantitativePCRusingtwoprimers,respectively,theresultsshow,theuseofthespecificprimersGBCH-QmaterialquantitativePCRanalysisshows:“06-146”strainsthetargetgeneexpressionindifferenttissues4dpeak;Xinhai14targetgenesin6dthereisamaximumvalue,andthendecreasedtotheoriginallevel;Zhongmiansuo35,Junmian1cottonandTM-1intheinductionofbeforeandaftertheinductionofexpressionofthevolumeisveryweakorrelativelyconsistent,remainingatalowlevelofexpression,quantitativePCRanalysisofthematerialshowsthroughtheuseofprimersStVe-Q:lines“06-146”,Xinhai14,Zhongmiansuo35,Junmian1cottonandTM-1targetgeneinthebacteria-inducedconditions,thereisnochangewiththeinductiontimeshowingexpressionstatus.DescriptiontheclonedRGBCH、SGBCHonlyexpressedinSeaIslandcottonmaterial,twogenesassociatedwithresistancetoFusariumwilt.4.RGBCHandSGBCHrecombinatingintopCAMBIA1301plantexpressionvector,constructingplantexpressionvectorpCAMBIA1301-RGBCHandpCAMBIA1301-SGBCH,RGBCHandSGBCHgeneintegratedintothetobaccogenomeusingofagrobacterium-mediatedmethod,obtainingT1generationseeds.T1transgenicandnon-transgenictobaccobrothpouredrootmethod(Eachmaterialof30planting),TurnRGBCHgenemostoftheleaveswereyellowing,plantsurvivalratewas78%,whilethesurvivalrateoftoturnSGBCHtransgenicplantsto24%,mostoftheleavesdrydeath,non-transgenicplantsalmostalldied.TheseresultssuggestthatthegenetransferredRGBCHtobaccoresistancetoFusariumwiltbacteria.Keywords:GossypiumbarbadenseL.;Fusarinmwilt;Linkedmaker;Real-TimePCR:FunctionalverificationIV 目录第一章绪论............................................................................................11.1抗病基因研究..................................................................................................11.1.1基因对基因假说....................................................................................11.1.2已克隆的植物抗病基因........................................................................31.1.3植物抗病相关基因的克隆方法............................................................71.1.3.4电子克隆技术.....................................................................................81.2棉花枯萎病研究进展......................................................................................91.2.1棉花枯萎病的分布与危害....................................................................91.2.2棉花枯萎病菌的类型及生理小种......................................................101.2.3棉花对枯萎病的抗性机理..................................................................111.2.4棉花枯萎病致病机理..........................................................................121.2.5棉花枯萎病抗性遗传研究..................................................................131.3RGA的研究进展...........................................................................................141.3.1作为一种新型的分子标记构建遗传图谱..........................................151.3.2用于基因定位......................................................................................151.4本研究要解决的问题....................................................................................16第二章RGA标记的开发及应用..........................................................172.1材料和方法....................................................................................................182.1.1实验材料..............................................................................................182.1.2主要试剂和仪器..................................................................................182.2方法..........................................................................................................182.2.1田间调查及抗病性鉴定......................................................................182.2.2抗病基因序列的查询...........................................................................192.2.3RGA引物的设计.................................................................................192.2.4RGA分析.............................................................................................202.2.5BSA(BulkedSegregantAnalysis)分池................................................202.2.6BSA分池标记记录及数据分析..........................................................202.3结果与分析....................................................................................................212.3.1RGA引物的设计.................................................................................212.3.2枯萎病病情田间调查及主要农艺形状的分析..................................222.3.3RGA引物的多态性筛选.....................................................................242.3.4RGA与枯萎病抗性的遗传连锁分析.................................................242.4讨论................................................................................................................26第三章海岛棉枯萎病抗性相关基因的克隆与生物信息学分析........283.1材料................................................................................................................283.1.1实验材料..............................................................................................283.1.2主要试剂和仪器..................................................................................29V 3.2方法................................................................................................................293.2.1目的基因片段的分离..........................................................................293.2.2同源序列克隆......................................................................................293.2.3总RNA的提取...................................................................................293.2.4cDNA第一链的合成...........................................................................303.2.5RGBCH和SGBCH基因的克隆.........................................................313.2.6基因的序列分析..................................................................................323.3结果与分析....................................................................................................333.3.1RNA的提取与检测.............................................................................333.3.2目的基因片段的获得..........................................................................343.3.3所获基因片段的克隆..........................................................................343.3.4基因克隆及序列分析..........................................................................363.3.5功能基因标记的获得与验证..............................................................433.4讨论................................................................................................................44第四章枯萎病抗性相关基因的组织特异性表达分析........................464.1材料................................................................................................................464.1.1实验材料..............................................................................................464.1.2主要试剂和仪器..................................................................................474.2方法................................................................................................................474.2.1总RNA的提取及cDNA合成...........................................................474.2.2棉种处理..............................................................................................474.2.3棉苗的培育..........................................................................................474.2.4菌种的准备..........................................................................................474.2.5棉苗接种..............................................................................................484.2.6棉花总RNA的提取及cDNA合成...................................................484.2.7荧光定量特异性引物的设计..............................................................484.2.8抗性相关基因表达分析......................................................................484.3结果与分析...........................................................................................................494.3.1不同组织器官的表达分析..................................................................494.3.2实时荧光定量熔解曲线......................................................................504.3.2枯萎病病原菌诱导下五种材料叶片组织的实时荧光定量分析......504.3.3枯萎病病原菌诱导下五种材料下胚轴组织的实时荧光定量分析..534.3.4枯萎病病原菌诱导下五种材料根组织的实时荧光定量..................554.4讨论.......................................................................................................................57第五章新疆海岛棉枯萎病抗性相关基因植物表达载体的构建和转基因植株的获得及抗性鉴定......................................................................595.1实验材料........................................................................................................605.1.1材料......................................................................................................605.1.2试剂......................................................................................................605.2实验方法........................................................................................................605.2.1RGBCH、SGBCH基因编码区的克隆...............................................60VI 5.2.2pCAMBIA1301-RGBCH、pCAMBIA1301-SGBCH植物表达载体的构建................................................................................................................615.2.3pCAMBIA1301-RGBCH、pCAMBIA1301-SGBCH植物表达载体的酶切和测序鉴定............................................................................................625.2.4根癌农杆菌EHA105感受态的制备.................................................625.2.5pCAMBIA1301-RGBCH、pCAMBIA1301-SGBCH转化EHA105.625.2.6根癌农杆菌中植物表达载体的检测..................................................625.2.7培养基..................................................................................................635.2.8转基因烟草的培育方法......................................................................635.2.9农杆菌介导的烟草遗传转化方案......................................................645.2.10转基因植株的筛选............................................................................655.2.11转基因烟草的接种............................................................................655.3结果与分析....................................................................................................655.3.1pCAMBIA1301-RGBCH、pCAMBIA1301-SGBCH植物表达载体的构建................................................................................................................665.3.2pCAMBIA1301-RGBCH、pCAMBIA1301-SGBCH植物表达载体的酶切检测........................................................................................................665.3.3根癌农杆菌中植物表达载体的PCR检测........................................665.3.4转基因烟草的获得..............................................................................675.3.5转基因烟草的鉴定..............................................................................685.4讨论................................................................................................................71第六章结论与展望................................................................................736.1RGA标记的开发与应用...............................................................................736.2RGBCH、SGBCH基因的克隆.....................................................................736.3抗性相关基因在海岛棉和陆地棉中的表达分析........................................736.4RGBCH、SGBCH基因植物表达载体的构建.............................................746.5展望................................................................................................................74参考文献..................................................................................................75致谢..................................................................................................83作者简介..................................................................................................84VII 常用缩略语中英文对照表缩略语英文全名中文名siglaEnglishnameChinesenameCTABCetyltriethylammoniumBromide十六烷基三甲基溴化铵DNADeoxyribonucleicAcid脱氧核糖核酸dNTPDeoxyribonucleosideTriposphate脱氧核苷三磷酸EBEthidumBromide溴化乙锭EDTAEhyleneDiaminetetraaceticAcid乙二胺四乙酸AmpAmpicillin氨苄青霉素ORFOpenReadingFrame开放阅读框bpBasePairs碱基对NCBINationalCenterBiotechnologyInformation国家生物技术信息中心（美国）PAGEPolyacrylamideGelElectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳PCRPolymeraseChainReaction聚合酶链式反应SDSSodiumDodecylSulphate十二烷基硫酸钠TEMEDN,N,N',N'-tetramethylethylenediamineN,N,N',N'-四甲基乙二胺TrisTris(hydroxymethyl)Aminomethane三（羟甲基）氨基甲烷IPTGIsopropyl-β-D-thiogalactopyranoside异丙基-β-D-硫代半乳糖苷RT-PCRReverseTranscriptasePCR反转录PCRDEPCDiethelPyrocabonate焦碳酸二乙酯cDNAComplementaryDNA互补DNABLASTBasicLocalAlignmentSearchTool比对搜索工具6-BA6-Benzylaminopurine6-苄氨基嘌呤bpBasepair碱基对CefCeftriaxoneSodium头孢曲松钠KanKanamycinSulfate卡那霉素LBLuria-BertanimediumLB培养基MSMurashigeandSkoogMS培养基NAAα-Naphthaleneaceticacidα-萘乙酸NPTIINeomyeinephosphotransferase新霉素磷酸转移酶ODOpticaldensity光密度RifRifampicin利福平RNARibonucleicacid核糖核酸rpmRevolutionsperminute转数/分T-DNATransferDNA转移DNAESTExpressedsequencetags表达序列标签VIII 新疆农业大学博士（硕士）学位论文第一章绪论海岛棉（GossypiumbarbadenseL.）原产于南美洲、中美洲及加勒比海诸岛。秘鲁是海岛棉的起源中心，有悠久的海岛棉种植历史（距今约有4500多年），目前一年生栽培种的海岛棉主要分为中亚型、埃及型和美洲型三大类型，生产上广泛种植的主要是中亚型和埃及型。海岛棉纤维品质的突出特点是长、细、强等特点。由于海岛棉的经济生产价值率高于其他棉花类型，是纺织业中高支精梳纱与特种织物不可缺少的原料。海岛棉的生产对于提高我国纺织产品档次、增强行业竞争力，起着不可替代的重要作用。自上个世纪中叶以来，我国成功引进苏联的海岛棉并在新疆地区迅速推广，并成为我国唯一的种植海岛棉的地方。据报道，引种成功到现在，海岛棉的培育经历了引种、系统选育、杂交育种三个阶段，不断培育出相对综合性状优良的海岛棉新品种，构建了一个较为稳定的技术体系，在海岛棉的生产中起到非常重要[2]的促进作用。棉花的枯、黄萎病是影响棉花生产最严重的病害。1891年首次在美国的Alabama州发现棉花的枯萎病，直到二十世纪三十年代，我国的冯肇传在华北地[1]区观察到枯萎病的出现，上世纪中叶，棉花的枯萎病传播到七个省、市，此后，开始大面积的加速蔓延。在过去的十年中，加速蔓延发展的枯萎病，影响海岛棉的生长，对海岛棉新品种的培育构成了极大的威胁。近年来，随着标记（引物）技术的飞速发展，为研究人员更有效地通过抗病品种或品系获得高品质的新品种提供了新方法，开辟了一条新的途径。然而，由于海岛棉抗性的分子遗传基础研究处于基本空白的初始阶段，因此，利用分子生物学方法研究海岛棉抗病的分子机制，不仅具有重大的理论意义，而且对于枯萎病抗性基因的研究具有实用价值。1.1抗病基因研究1.1.1基因对基因假说1 海岛棉枯萎病抗性相关基因的克隆及功能验证美国植物病理学家Flor通过亚麻对亚麻锈菌的小种特异抗性遗传规律的研究，得出基因对基因假说(gene-for-genehypothesis)的理论，揭示植物与病原菌亲[3]和互作和非亲和互作的遗传基础。到目前为止，已被证明至少几十种不同的植物和病原微生物的互作，包含真菌、细菌、病毒引起的病害、线虫寄生种子植物引起的病害(表1-1)。假说的大致内容为：病原菌-病原菌中的无毒基因(avirulencegene，Avr)与其寄主植物-寄主植物抗性基因(resistancegene，R)是一对互作基因。当二者均为显性时，植物和病原菌表现非亲和互作，病原菌无毒，植物抗病；当二者中任何一个为隐性时，植物和病原菌表现亲和互作，病原菌有毒，植物感病。在分子水平上，这种假说能很好地被配体-受体模式加以解释，即病原菌无毒基因直接或间接编码产物（配体），特异性地被植物互补抗病基因编码产物（受体）所识别，激发植物产生抗病反应。如果病原菌缺少无毒基因或植物缺少抗病基因时，这种识别作用不能完成，病原菌有毒，植物感病（图1-1）。。表1-1已证实或推证出存在基因对基因关系的病害系统Table1-1Thegene-to-genediseasessystemforconfirmorProofoftheexistenceoftherelationship寄主病原类型病原物HosttypeofpathogenicPathogen燕麦(Avena)F燕麦秆锈病菌(P.graminisavenae)F燕麦冠锈病菌(Pucciniacronate)F燕麦散黑穗病菌(Ustilagoavenae）N燕麦胞囊线虫(Heteroderaavenae)咖啡(Cffea)F咖啡锈病菌(Hemileia-vastarix)向日葵(Helianthus)F向日葵锈病菌(Pucciniahellianthi)PF向日葵列当(Orobanchesp.)大麦(Hordeum)F大麦白粉病菌(Erysiphegraminishordei)F大麦散黑穗病菌(Ustilagohordei)棉花(Gossypium)B棉花角斑病菌(Xanthomonasmalvacerum)亚麻(Linum)F亚麻锈病菌(MelampsoraLini)番茄(Lycoprrsicum)V番茄斑萎病(SpottedWiltVirus)V番茄叶霉病菌(Cladosporiumfulvum)苹果(Malus)F苹果黑星病菌(Venturiainequalis)玉米(Zea)F玉米锈病菌(Pucciniasorghi)水稻(Oryza)F水稻稻瘟病菌(Pyriculariaoryzae)2 新疆农业大学博士（硕士）学位论文续上表寄主病原类型病原物HosttypeofpathogenicPathogen菜豆炭疽病菌(Colletotrichum菜豆(Phaseolus)Flindemuthianum)菜豆普通花叶病毒(BeancommonmosaicFVirus)马铃薯(Solanum)V马铃薯金线虫(Heteroderarostochiensis)N马铃薯晚疫病菌(Phytophthorainfestans)F马铃薯癌肿病菌(Synchytriumendobioticum)F马铃薯病毒病菌(Xvirus)小麦(Triticum)F小麦秆锈病菌(Pucciniagraministritici)F小麦条锈病菌(P.striformes)F小麦叶锈病菌(P.recondita)F小麦网星黑穗病菌(Tilletiacaries)F小麦矮星黑穗病菌(T.controversa)F小麦散黑穗病菌(Ustilagotritici)F小麦白粉病菌(E.g.tritici)I小麦瘤蚊病菌(Mayetioladestructor)注：B：细菌；F：真菌；I：昆虫；N：线虫；V：病毒；PF：寄生性种子植物Note:B:bacteria;F:fungi;I:insects;N:nematodes;V:virus;PF:parasiticseedplants图1-1植物与病原菌基因对基因互作模式示意图Fig.1-1Sketchmapofgeneforgeneininteractionalmodelbetweenplantandpathogen1.1.2已克隆的植物抗病基因根据基因-基因假说，作物的抗性基因和病原菌的无毒基因发生互补，它对寄主植物进行专化性的识别、并激发抗病反应的基因。抗病基因的编码产物是抗病反应信号传导的始端，当它和病原菌的无毒基因直接或间接的编码产物发生互补结合以后，借助信号传导，作物的抗性反应被激发出来。分离并且克隆相应的3 海岛棉枯萎病抗性相关基因的克隆及功能验证抗性基因，研究它们的结构和功能，对于作物抗性分子机制的阐述和改良作物抗性具有非常重大的意义。表1-2列出了64个抗性基因，是从不同的植物中克隆的，分别是抗线虫病的基因有6个，抗细菌病的基因有21个，抗真菌病的基因有31个，抗病毒病的基因有6个。克隆的这些抗性基因大多数具有NBS-LRR类结构域，且是由遗传背景比较清楚、遗传图谱比较完善的植物或模式植物中得到，如拟南芥、水稻等。到目前为止在海岛棉中没有克隆出来抗性基因。表1-2已克隆的植物抗病基因Tablel-2Theclonedresistancegenesfromplant供体抗病基因病原菌结构特征参考文献DonerRgenePathogenStryctreReferenceXanthomonascampestrisOryzasativaXa-21LRR,PKSongeral.,1995pv.oryzaeXanthomonascampestrisXa-21DNBS-LRRWangetal.,1998pv.oryzaeXanthomonascampestrisYoshimuraetXa-1LZ-NBS-LRRpv.oryzaeal.,1997XanthomonascampestrisXa-13NBS-LRRByranetal.,2000pv.oryzaePi-bMagnaporthegriseaNBS-LRRWangetal.,1999NakamuraetPi-taMagnaporthegriseaNBS-LRRal,.1997Pi9MagnaporthegriseaNBS-LRRQuetal.,2006SolanumBendahmanedtRx-1PotatovirusXLZ-NBS-LRRtuberosumal.,1999BendahmanedtRx-2PotatovirusXLZ-NBS-LRRal.,2000VandervorrtetGpa2GloboderapallidaLZ-NBS-LRRal.,2000Gro1-4GloboderarostochiensisNBS-LRRPalletal.,2004R1PhytophthorinfestansLZ-NBS-LRRBalloraetal.,2002HordeumBrueggemanetMlaErysiphegraminisLZ-NBS-LRRvulgareL.al.,2006ErysiphegraminisMloTM-TMBuschgesetal.,1997f.sp.hordeiErysiphegraminisMla1LZ-NBS-LRRZhouetal.,2001f.sp.hordei4 新疆农业大学博士（硕士）学位论文续上表供体抗病基因病原菌结构特征参考文献DonerRgenePathogenStryctreReferencePucciniagraminisBrueggemanetRpg1RKLPf.sp.triticial.,2002RMo1MagnaportheoryzaeUnknownInukaietal.,2006Rh2RhynchosporiumsecalisUnknownSchmidtetal.,2001ZeamaysHm1CochlioboluscarbonumTRJohaletal.,1992Rp1-DPucciniasorghiLZ-NBS-LRRCollinseral.,1999TriticumCre3HeteroderaavenaeNBS-LRRLagudahetal.,1997vulgareLr10PucciniareconditavarPKFeuilletetal.,1997Lr21PucciniareconditavarUnknownHuangetal.,2003ArobidopsisPseudomonassyringaeRPS2LZ-NBS-LRRBentetal.,1994thalianapv.tomatoRPM1PseudomonassyringaeLZ-NBS-LRRGrantetal.,1995TIR-NBS-LRRPP5PeronosporaparasioticaParkeretal.,1997RTIR-NBS-LRVanderBiezenetRPP4PeronosporaparasioticaRal.,2002McDowelletRPP8PeronosporaparasioticaLZ-NBS-LRRal.,1998RPS5PseudomonassyringaeLZ-NBS-LRRWarrenetal.,1996TIR-NBS-LRGassmannetRPS4PseudomonassyringaeRal.,1999RPW8ErysiphecruciferarumNBS-LRRXiaoeral.,2001TIR-NBS-LRDeslamdesetRRS1-RRalstoniasolanacearumRal.,2002TIR-NBS-LRRPP1PeronosporaparasioticParkeretal.,1996RTIR-NBS-LRSsi4PseudominassyringaeShiranoetal.,2002RBittner-EddyetRPP13PeronosporaparsiticaLZ-NBS-LRRal.,2000HRTTurniipcrinklevirusLZ-NBS-LRRKachrooetal.,2000RPP27PeronosporaparasiticaPLPToretal.,2004TakahashietRCY1CucumbermosaicvirusNBS-LRRal.,20025 海岛棉枯萎病抗性相关基因的克隆及功能验证续上表供体抗病基因病原菌结构特征参考文献DonerRgenePathogenStryctreReferenceLycopersicuPseudomonassyringaePtoPKMartinetal.,1993mesculentumpv.tomatoCf-9CladosporiumfulvumLRR-TMJonesetal.,1994Cf-2CladosporiumfulvumLRR-TMDixonetal.,1996I2CFusariumoxysporumNBS-LRROrietal.,1997Cf-4CladosporiumfulvumLRR-TMThomasetal.,1997Cf-5CladosporiumfulvumLRR-TMDixonetal.,1999MiMeloidogyneincognitaLZ-NBS-LRRMilliganetal.,1998I2FusariumoxysporumNBS-LRROrietal.,1997VeVerticilliumalbo-atrumCSLRKawchuketal.,2002HeroGloboderarostochiensisNBS-LRREmstetal.,2002PseudomonassyringaePrfLZ-NBS-LRRSalmeronetal.,1996pv.tomatoFenPseudomonassyringaePKMartinetal.,1994BrommonschenkelSw-5TospovirusLZ-NBS-LRRetal.,2002Hcr-4eCladosporiumfulvumLRR-TMTakkenetal.,1998Cf-ECP2CladosporiumfulvumUnknownJoostenetal.,1999PseudomonassyringaeBrandwagtetAscUnknownpv.tomatoal.,1998;2000SchomackerBs4XanthomonascampestrisNBS-LRRal.,2004LinumTIR-NBS-LRL6MelampsoraliniLawrenceetal.,1995usitatissimumRTIR-NBS-LRMMelampsoraliniAndersonetal.,1997RTIR-NBS-LRP/P2MelampsoraliniDoddsaetal.,2001RTIR-NBS-LRL11MelampsoraliniEllisetal.,1999RNicotianaTIR-NBS-LRNTobaccomosaicvirusWhithametal.,1994tabacumRpro1BetavulgarisHs1HeteroderaschachtiiLRR-TMCaietal.,19976 新疆农业大学博士（硕士）学位论文续上表供体抗病基因病原菌结构特征参考文献DonerRgenePathogenStryctreReferenceLactucaDm3BremialactucaNBS-LRRShenetal.,1999sativaCapsicumBs2XanthomonascampestrisNBS-LRRTaietal.,1999annuumBs3XanthomonascampestrisNBS-LRRJordanetal.,20061.1.3植物抗病相关基因的克隆方法1.1.3.1图位克隆图位克隆法(mapbasedcloning或positionalcloning)是基于分子标记图谱克隆基因的方法。在具备以下两方面的条件：首先，根据目的基因的遗传隔离群体，如RI、F、DH、BC等。其次，定位到与目标基因紧密的连锁标记并定位到特定的连锁群或染色体上，即可开展图为克隆。图为克隆的过程可以包含以下步骤（1）构建含有大插入片段的基因组文库（BAC库或YAC）;（2）相关的分子标记与靶基因作为探针筛选基因组文库;（3）用获得阳性克隆构建目的基因区域的跨叠群；（4）通过染色体步移(chromosomewanting)、登陆和连接(chromosomeland)获得含有目标基因的大片段克隆；（5）通过亚克隆获得含有目的基因的小片段克隆。克隆的基因通过遗传转化和功能验证最终确定目标基因的碱基序列。大多数已知的（至少超过40）的抗性基因，应用该方法克隆获得，如番茄Pto、Prf、水稻Xa21、Pi-b等。近年来，随着不同植物各种标记的高密度遗传图谱和物理图[4]谱的构建，图位克隆技术的应用前景更加广阔。7 海岛棉枯萎病抗性相关基因的克隆及功能验证图1-2图位克隆技术的过程Fig.1-2Map-basedcloningtechnology1.1.3.2转座子标签转座子标签（transposontagging）的技术原理是：以转座子为探针克隆到突变的基因，然后用突变的基因为探针，由野生型的个体里分离野生型的基因，并将该基因克隆出来，最后获得完整基因的技术方法。转座子标签是研究功能基因的有效技术工具之一。转座子标签法不但可以通过上述转座突变分离基因，而且当转座子作为外源基因通过农杆菌介导等方法导入植物时，还会由于T-DNA整合到染色体中引起插入突变，进而分离基因，因此大大提高了分离基因的效率。至少10个基因是应用此方法克隆获得的，如番茄Cf-2、Cf-9、玉米Hm1等。转座子抗性基因的克隆需要一个很好的标签系统，植物感、抗表现涉及植物、病原[5]体、复杂的环境，突变的筛选需要多代再生植株和多年的观察研究。图1-3转座子标签技术的过程Fig.1-3Transposontaggingtechnology1.1.3.3同源序列克隆又称抗病基因类似物(resistance-geneanalog，RGA)克隆法。此方法的基础是目前克隆的植物抗病基因具有保守基序，如LRR、NBS、LZ和蛋白激酶等，根据上述保守区域的序列设计引物，对基因组进行扩增，得到与抗性基因比较相似的基因序列，这些抗病基因序列在被分离的情况下，如果他们与抗病基因紧密连锁，或带有抗病基因同源序列，可以用探针筛选基因组文库，获得候选抗病基因。自[6-7]1996年以来，该方法已被报道，使用RGA来定位、克隆抗性基因已被广泛应[8-26]用。从水稻、小麦、棉花等二十多种植物上扩增出一大批抗病基因同源序列。[27][28]例如小麦抗叶锈病基因Lr10和马铃薯X病毒基因Rx2等。1.1.3.4电子克隆技术8 新疆农业大学博士（硕士）学位论文电子克隆技术（insilicocloning）是基于表达序列标签（expressedsequencetags，ESTs）的策略，是最近几年来崛起的快速克隆基因的一门新技术，它的技术重点是通过生物分子信息学的技术，拼接延长ESTs的序列，得到该基因的片段或至全长的cDNA基因序列，再通过反转录PCR方法对克隆的基因进行分析、验证。从GenBank的核酸（nr）数据库中检索已测序列植物的目的基因，获得目的基因cDNA序列，用该序列作为模板，在EST的数据库进行BLAST搜索，搜索一条未测序列的植物，获得和它部分序列同源或重叠的EST群，从中选择一条EST的序列为种子基因序列，在此作物的EST数据库中进行比对查找，把搜索出来的有部分重复的EST及和种子的序列相似性偏高的序列拼接成重叠群，再以此重叠群序列重复以上BLAST检索过程，反复进行EST重叠群序列的拼接和比对，直至检出所有的重叠EST或重叠群不能继续延伸，最终获得未测序列植物基因的cDNA全序列。随着EST数据库的进一步完善，电子克隆策略已成为克隆新基因的重要方法，并成功地应用于人类基因组的研究。通过EST数据库资料的电子克隆，成为功能基因的克隆的一个新方法，较常规的克隆基因技术相比较，拥有快速、价格低、特异性强等一些特点，但也受到dbEST的EST数量和质量的限制，因此在EST数据非常丰富的模式物种（如人、鼠等）中应用较多。在现实生产中，用模式物种已知某一基因序列作起点，与目标物种的数据库相结合，通过分子生物学和实验验证相互结合，特别是利用同源性的比较，可以快速的筛选到某些拥有特殊功能的基因。近来电子克隆技术已经广泛应用于小麦[29-32][33][34-35][36][37][38-42][43-45][46]、紫菜、棉花、黄瓜、花生、玉米、向日葵、油菜、[47-49][50-52]大豆、人类等基因组的研究。1.2棉花枯萎病研究进展1.2.1棉花枯萎病的分布与危害棉花枯萎病菌（Fusarinmwilt）是一种专化性较强、寄主范围较窄的病菌，除危害棉花外只能危害秋葵和决明。棉花枯萎病在幼苗期即可发病，严重时造成9 海岛棉枯萎病抗性相关基因的克隆及功能验证大量死苗、缺苗、断陇、甚至毁种。发病轻的棉株虽能存活，但棉株生育受到阻碍，导致过早落叶、蕾铃脱落、铃重下降、产量降低、品质变劣。1891年在美国亚拉巴马州首次报道棉花枯萎病，随后很快在其他几个州发现，逐渐发展到整个棉花种植带。20世纪末期，棉花枯萎病遍及亚洲，非洲，北美，南美和欧洲地区，包括印度，巴基斯坦，缅甸，伊拉克和其他许多国家，几[53]乎遍布整个世界种植棉花的国家。1931年，冯肇传最早发现棉花枯萎病在华北地区发生；1934年，黄芳仁发现[54]棉花枯萎病在江苏南通地区发生；沈其益发现棉花枯萎病在南京、上海地区发[55]生。后来棉花良种繁育，运输和销售，发病区域已经逐年扩大，成为越来越严重的危害。1949年前，棉花枯萎病已经扩展到7个省、直辖市；1949年后，随着发展农业生产，不断扩大的棉花产区，棉花种子运输，再加上实施无效的检疫措施和控制措施。在整个60年代棉花枯萎病的传播扩大，蔓延加速以致危害我国主要产棉省、市、自治区。1.2.2棉花枯萎病菌的类型及生理小种棉花枯萎病菌（Fusariumoxysporum.f.sp.Vasinfectum(Atk)Snyderethansen）属于半知菌亚门瘤座孢科的镰刀菌属。将世界范围内的棉花枯萎菌菌系区分为4个生理小种，1、2、3、4号小种，依据是棉属鉴别寄主（海岛棉：SakelAshmouniCoastland，陆地棉：AcalaRowdenStoneville和亚洲棉：Rozi；非棉属：紫花苜蓿，烟草，大豆），美国型：1号小种，分布窄，主要感染陆地棉，2号小种，分布较广，感染陆地棉、大豆、金元烟草；埃及型：3号小种，感染海岛棉；印度型：4号小种，感染亚洲棉；苏丹型：5号小种，感染海岛棉。1978年在巴西还发现一个新菌系命名为6号小种，感染陆地棉、秋葵。自1986年开始，陈其英等致力研究中国棉花的枯萎病病原菌的致病能力，同[56]时比较与国际上报道的6个小种有无区别。于是，我国首次报道7号和8号生理小种，7号小种高度感染亚洲棉、海岛棉和陆地棉，对5个非棉属的寄主无感染或轻度感染；8号生理小种尤其感染紫苜蓿，轻度感染非棉属的大豆、秋葵和烟草，对3个棉种的7个品种无感染或轻度感染；仅在我国发现；3号小种在我国也有发10 新疆农业大学博士（硕士）学位论文现，主要存在于南京（江苏省）、新洲县和麻城县（湖北省），严重感染海岛棉品种Coastland、Sakel和亚洲棉品种Ronzi，极轻度感染紫苜蓿，不感染海岛棉品种Ashmouni、陆地棉、秋葵、烟草和大豆、。1.2.3棉花对枯萎病的抗性机理A抗性寄主的抗病反应B寄主的感病机理图1-4植物对病原体产生的激发与抑制反应Fig.1-4Thepathogensstimulateandinhibitofplantreaction抗性寄主可以识别病原体引发子的释放，并引起反应激活的信号转导的系统（如肌醇磷脂信号系统，钙信号系统，环核苷酸的信号系统）的钙识别和蛋白酶的磷酸化。诱导抗性基因的活化，导致生物合成植物抗毒素，病原体相关蛋白抗病因素，从而抵抗病原体感染。抑制剂能抑制病原体如寄主特定毒素（主机特定的毒素，HST）ATP在质膜中酶的活性，使之丧失质膜的信号转导系统的功能，而不能及时作出反应，病原体感染，即抗性基因不活化，细胞不合成抗病毒因子；病原体抑制剂也可能直接抑制的抗病基因的表达，因此寄主易感染。一般认为是由于棉花枯萎病菌的受到物理阻碍和化学抑菌作用，化学抗菌发挥主导作用。有研究发现，棉花抗病品种和易感枯萎病菌品种，维管束外无显著差异。差异存在于病菌在维管束中的定殖阶段。抗病品种的主侧根和茎的导管细胞壁厚，细胞的每单位面积的木质部，单元间隙小，髓射线的数量繁多，11 海岛棉枯萎病抗性相关基因的克隆及功能验证抗性和敏感品种的植物抗毒素的形成速度和强度的差异表现出不同的抗性。冯洁等的研究表明，棉花种子内凝集素活性程度与品种抗枯萎病能力呈正相关，对棉花抗枯、黄萎病相关的酶进行了研究，与棉花品种对枯萎病的抗性与PAL活性有密切关系的酶，分别是，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、[57-58][59]多酚类氧化酶（PPO）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）。宋小轩等报道发现，抗病品种的水平PAL活动高于易感病品种。国内研究人员的结论是，大部分感染棉花枯，黄萎病后过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性增加，感病品种的增长水平高于抗病品种。由此可见，棉花抗枯萎病机制较为复杂，涉及因素较多，除了受寄主抗性差异的影响，但也受到细菌的毒力强弱和环境的影响。1.2.4棉花枯萎病致病机理自尖孢镰刀菌的发现以来一直存在两种观点。一种观点认为，病株导管由于菌丝体和孢子大量繁殖拥塞，水和营养输送困难，多酚氧化酶在同一时间氧化果胶物质，致使导管变成褐色；另一种观点认为是由细菌毒素产生破坏的叶肉细胞质膜的通透性，使植物吸水困难，不及时补充失去的水分蒸腾，造成植物褪绿黄。棉花枯萎病菌分泌枯萎病酸对棉花有致萎作用，但棉花镰刀菌酸枯萎病发展中的作用，多年来，不同的研究者有不同的看法。其中之一是，致病力强弱和镰刀菌酸的量呈正相关，另一种镰刀菌酸在植物病害的发展中，无显著意义，病原体毒力的强度与产生镰刀菌酸的量没有直接关系。经研究发现，黄炜、徐孝华等报道镰刀菌酸是一种非寄主特异性致病毒素，由枯萎病菌产生，且产量极其不稳定，[60-61]和致病力强弱无显著相关性；吕金殿等报道由于培养不同枯萎菌菌株的方式[62]不同，致使培致萎力存在相当的差异。海内外研究人员通过进一步分析棉花枯萎病菌的毒素化学成分。甘莉等通过亲和层析纯化毒素的技术，证明棉花病菌毒素活性是由一种含85.26%的蛋白质和14.74%的糖的酸性糖蛋白组成，并证实该[63]蛋白是决定棉花黄萎病菌致病强弱的关键因素。江怀仲等实验表明棉花落叶型枯萎菌株所产毒素与非落叶型枯萎菌株所产生的毒素高2-3倍，且发现导致棉苗[64]萎蔫的主要因素是毒素复合体中的蛋白质。所以，致使棉花发生萎蔫的因素较12 新疆农业大学博士（硕士）学位论文多，不要仅把它看成是单一的导管堵塞或者病原菌产生的毒素所致，全面综合考虑病原菌侵入棉花后病原菌、寄主、环境三者之间的复杂互作作用。1.2.5棉花枯萎病抗性遗传研究国内外学者对枯萎病的棉花遗传抗性报道较多，结论并不完全一致。这一结果的主要原因是复杂的棉花抗病性，不仅受病原菌遗传因素的影响，还遭受到寄主自身遗传条件的约束，并同时遭受这两者的相互作用的约束。一般认为的棉花抗枯萎病遗传是由多基因控制，或者由一个主基因和多个微效基因的影响，或由两个显性基因和一个抑制因子的共同抑制。Fahmy于1927年利用免疫品种与感病品种杂交，由F2分离出免疫株（占3/4），耐病株（占3/20）和感病株（占1/10），免疫株具有稳定性不再进而分离，抗病株又可再同时再次分离出抗病株、免疫株或三种类型都有包含，而感病株大多枯死在苗期。Dick等在1960年研究发现，陆地棉对枯萎病的抗病性由一个主效显性基因和一些修饰基因共同控制着，由2个加性效应的显性基因控制着海岛棉的抗[65]病性。Jones于1961年用德字棉425（抗病）、珂字棉100GA（抗病）与感病的半棉构建杂交组合群体，在F2、F3群体单株中，抗病、耐病、感病单株数量呈显[66]连续变化，遂认为是受数量性状遗传控制，抗性是由2-3个基因所控制。Kappelman在1971年，通过6种不同条件对6个世代（P1、P2、F1、F2、B1F1、B2F1）进行实验发现，仅限于他所研究的实验材料而言，加性基因效应最终反映出棉花[67]枯萎病抗性的遗传规律。但是，Netzer在1985年提出不同意见，他利用陆地棉[68]与海岛棉构建杂交群体，得出棉花枯萎病抗性是由一个显性基因所控制。我国的研究者在对抗病育种方面的研究也取得了大量的成果。沈其益发现，[69]棉花抗枯萎病的遗传效应受双亲（父母本）控制呈不完全显性。王远等报道发现，若双亲任何一个具有抗枯萎病性，它的杂交后代一定表现抗病性，那是因为[70]陆地棉抗枯萎病受显性基因控制。因此，杂交母本选择感病、高产、品种优质的，杂交父本选择高抗枯萎病品种，以期望培育优质、高产、抗病性强的品种。张金发等实验说明，棉花抗枯萎病性呈现部分显性，加性效应占主导因素，无上位性，显性效应偏小，高达83%的狭义遗传力，推测枯萎病抗性的遗传至少受到13 海岛棉枯萎病抗性相关基因的克隆及功能验证[71]一组显性抗病基因控制。张凤鑫等报道显示，86.7%的广义遗传率在陆地棉抗[72]枯萎病性的遗传中，属于遗传率较高的性状。任爱霞等认为棉花对枯萎病的抗性可能是由隐性基因控制，或者由两对一隐一显的主效基因和多个微效基因共同[73]控制。曲健木等通过构建抗×抗、抗×感、抗×耐三种类型不同的组合，用于分析遗传规律，实验表明组合中棉花抗枯萎病性遗传的加性效应均达到显著水平，[74]推测抗枯萎病性遗传是受多基因的控制。另外，研究还发现，在构建的枯萎病混合病圃中，棉花枯萎病抗性受多对不同基因控制，并且基因的作用颇为复杂。此外，棉花抗枯萎病的基因型与环境互作方差达到了显着水平，枯萎病棉花抗病受到环境因素的影响。1.3RGA的研究进展抗病基因同源序列(ResistanceGeneAnalog，RGA)是一种存在于植物基因组中、与至今已分离出来的植物抗病基因的保守序列有较高同源性的DNA片段。TIR-NBS-LRR和CC-NBS-LRR(non-TIR-type)的NBS结构域中均含有P-loop、锚定区域、MHDV和GLPL四个保守的基序。Kanazin和Yu等发展了一种克隆RGA的新方法－同源序列克隆法，即根据NBS结构域中的保守序列设计简并引物，通[75-76]过PCR的方法从植物基因组中克隆RGA。利用此方法，他们从马铃薯和大豆中克隆得到了一些RGA。自此以后，人们利用同源序列克隆法从柑桔、杏、葡萄、苹果、水稻、香蕉、棉花、花生等多种植物中克隆了RGA。遗传分析表明，RGA广泛分布在基因组中，通常成簇存在，在染色体上呈不均匀分布，经常在某一染色体上的分布多于其它染色体。拟南芥中的RGA序列大约有150个，可以分成40个单基因和43个基因簇，其中TIR的数量与non-TIR数量之比大约为2:1，这些RGA在1号和5号染色体上分布较多，2号和3号染色体上相对较少。水稻中含有600个NBS编码序列，这些序列可以分成44个基因簇和125个单基因，大约有25%的[77]NBS基因分布在11号染色体上。RGA与R基因之间的关系已知有三种。第一，RGA是R基因的一部分，如拟南芥中的一类RGA与RPP5紧密连锁，被证明是RPP5的一部分；第二，RGA与R14 新疆农业大学博士（硕士）学位论文基因紧密连锁。在水稻、大麦、小麦、玉米和菜豆中都得到了与已定位的不同R基因紧密连锁的RGA。这些RGA可用作探针，直接筛选DNA文库以克隆相应的R基因。Meyers等用RGA作探针，得到了一段DNA序列，此序列可能就是Dm3抗[78]性基因；第三，RGA与抗病基因无关。在拟南芥中，用近等基因系未找到与一些已知R基因紧密连锁的RGA。总的来说，RGA在一定程度上反映了R基因，分离和克隆植物的RGA已成为克隆植物抗病基因的新策略。1.3.1作为一种新型的分子标记构建遗传图谱Collins等在玉米中鉴定了20个RGA，并首先把它们作图到已知携带R基因的[79]染色体区域，第二年又从玉米中成功地克隆出了Rp1-D基因，是对枯锈菌[80](Pucciniasorglu)有抗性的由约9个同源基因构成的复合基因座的成员之一。Chen等根据R基因保守序列LRR，NBS和STK设计引物，在F重组自6交系(recombinantinbredlines，RIL)中扩增到的多态性条带显示为单座位遗传，[81]还发现以STK为引物获得的RGA和小麦抗条锈病基因之间存在一定连锁关系。这种新型指纹技术后来被称为抗病基因同源序列多态性(Resistancegene-analogpolymorphism，RGAP)。[82][83][84][85][86]利用RGAP的方法，已经为小麦、芸薹、大豆、玉米、大麦等的R基因成功地建立了分子标记(Molecularmarkers)。DiGaspero和Cipriani还将葡[87]萄的2个RGA家族转化为与抗病性相关的STS(Sequence-taggedsite)标记。1.3.2用于基因定位1.3.2.1质量性状的基因定位Donaid等检测到3个RGA标记紧密连锁到葡萄抗白粉病RunI基因座，其中2个(GLP1-12和MHD145)与之共分离，结果表明，RGA序列与BSA相结合能够[88]快速地产生与作物抗性紧密连锁的标记。[89][90][91]现有在黑麦、糖甜菜、向日葵等中分别将序列特异产生的RGA标记连锁或定位到抗线虫基因座Ha2、抗白粉病基因座Pm17、抗甜菜丛根病、褐斑病基因座Rh1和AB4、抗霜霉病的P15和P18基因座上。15 海岛棉枯萎病抗性相关基因的克隆及功能验证1.3.2.2数量性状的基因定位RGA也被成功地应用于各种QTLs分析中。Byme等将玉米黄酮合成代谢途径中的相关候选基因与寄主的跟一个玉米幼虫抗性QTLs相联系的防御反应表型[92]关联起来。[93][94][95][96]现已在大麦、番茄、鹰嘴豆及水稻中将RGA分别与抗白粉病和叶锈病、抗茎枯病、抗早疫病和晚疫病及抗稻瘟病、细菌性疫病、鞘枯病和褐稻虱的QTLs共定位。1.4本研究要解决的问题棉花枯萎病一直是世界和中国棉花抗病育种需要克服的重点因素。国内外学者对棉花枯萎病致病力分化，抗病机制，抗病机理，抗性鉴定，抗性遗传和分子标记等等已做了很多卓有成果的研究，但仍难以满足棉花生产和发展的需要。因此，从棉花生产的需要为出发点，进一步解决发展中存在的问题，有利于棉花抗病育种，提高疾病预防和控制，具有重要的理论和现实意义。利用构建的海岛棉杂交F2群体开展海岛棉枯萎病抗性分子标记研究，运用同源克隆方法，获得海岛棉枯萎病抗性相关基因的cDNA全基因序列，然后构建该基因的植物表达载体，利用农杆菌介导技术，将该基因导入模式植物烟草中，经过抗性标记基因的抗性筛选，DNA水平上及RNA水平上的PCR分子检测获得转基因阳性植株，通过对不同棉株不同组织器官进行枯萎病病原菌诱导，对该基因的功能进行初步研究，辅助培育棉花抗病新品种。16 新疆农业大学博士（硕士）学位论文第二章RGA标记的开发及应用海岛棉在栽培种中品质最优，因为其纤维具有强、长、细等一些突出特点，是纺织高支精梳纱和特种面料不可缺少的原料。因此，海岛棉生产对于中国纺织产品档次的提高、行业竞争力的增强发挥着重要作用。在过去的十年中，在新疆陆地棉枯萎病抗性研究取得较大进展，大部分陆地棉品种枯萎病抗性得到提高，但是海岛棉枯萎病抗性较差，加之棉花连年种植，导致枯萎病迅速蔓延，严重威胁着新疆海岛棉的生产。枯萎病病菌主要是从主根或侧根伤口侵入棉花苗期的幼苗根部，从而致使分生孢子的产生并向上扩散，抗病性弱的品种最终导致整株感染而枯萎，因此生产中急需抗病品种。然而，有关海岛棉抗病机制研究还不清楚，[97]这给培育抗病海岛棉新品种带来了困难。由于棉花栽培品种的遗传基础狭窄，使棉花标记辅助育种显得更为重要。抗病基因同源序列(Resistancegeneanalog，RGA)是一种存在与作物基因组中，与迄今分离发现的作物抗病基因中保守区域具有较高同源性的DNA片段。[98]孙涛等通过Entrez检索已发表的作物抗性基因编码蛋白质的序列，选取NBS(Nucleotide-bindingsites,核苷酸结合位点)类13个R基因的蛋白质，和棉花的RGA编码氨基酸的序列进行同源性比对发现，Genebank上棉花的RGA序列和其它作物的均有很高的同源性，分值最高的是AY244694编码蛋白质序列、烟草的抗TMV的N基因所编码的氨基酸蛋白质序列、引物Gbrga535和番茄的枯萎病的抗病基因I2C-1所编码的蛋白质序列，分值达到50%以上。自1996年Kanazin等和Yu等首先通过抗病基因的保守结构区域设计引物，用来分离大豆抗病性相关基因家族研究开始，到目前为止，国内外利用RGA技术已成功研究多种作物的遗传结构，找寻和抗性相关的标记，从而有利于MAS及病害的控制。本研究选用海岛棉抗枯萎病与感枯萎病品种的杂交亲本及180个17 海岛棉枯萎病抗性相关基因的克隆及功能验证株系的F2群体进行抗性基因连锁分析，利用抗病基因的保守结构域NBS类蛋白设计RGA引物，发掘与抗病基因紧密连锁的RGA标记，以期为分子标记辅助抗病育种奠定基础。2.1材料和方法2.1.1实验材料本实验所选用父本为新疆农科院经作所以丰产性好、优质品系K-117（新海12号×SO3）为母本，以抗病品种新海15号为父本，于2001年配置杂交组合，经多年南繁北育，于2006年选育而成的具有高抗病性海岛棉新品系“06-146”。母本为新疆生产中主栽品种新海14号。2007年本实验室以“06-146”和感枯萎病的海岛棉品种新海14号配制杂交组合，南繁加代得到F1代。2008年种植F1，单株自交得到F2种子。2009年种植F2种子，从F2群体中随机选取180株，用于苗期抗病性调查。在苗期摘取嫩叶片，并采用改良的CTAB法提取各材料的总DNA。2.1.2主要试剂和仪器Taq酶、PCR缓冲液、MgC12、dNTPs均购自上海生工。PCR仪为BIO-RAD公司型MyCycler；电泳仪为DYY-6C型、电泳槽为DYCZ-30型、DYCZ-20D型从北京六一公司购进，摇床为WD-9405B、HY-2型。天平为(1/10000、1/1000、1/100、1/10g)各一台。Eppendorf单道移液器（0.1-2.5、0.5-10、2-20、2-200、100-1000µL）一套等。2.2方法2.2.1田间调查及抗病性鉴定苗期对亲本、F2群体单株进行抗性调查，统计发病的病级数。调查方法采用[99]吴征彬等的方法，田间病圃的病菌经鉴定属于枯萎菌生理7号小种。成熟期进行定点调查（连续10株）株高、有效果枝数等农艺性状。亲本材料及F2家系群体分别种植于新疆农业科学院经作所库尔勒基地田间病圃。18 新疆农业大学博士（硕士）学位论文2.2.2抗病基因序列的查询通过参考国内外有关抗病基因方面的文献，得到已知的抗病基因，比如番茄抗叶霉病的基因Cf-2，Cf-4，Cf-5和Cf-9等、水稻的Xa-21基因、拟南芥的FLS2Pro-1基因、RPW8.2和RPW8.1基因、玉米的Hm1及Hs1和Asc等其他的R基因。登录NCBI、DDBJ、EMBL等数据库，利用文章中给出的各个基因的登录号，搜寻到[100]已经发表的抗病基因（表2-1）。表2-1己知抗病基因的列表Table2-1ThesummaryinformationofpublishedRgenes供体/病原菌抗病基因蛋白质结构登录号Doner/PathogenRgeneProteinStructureIDLinumusitatissimum/MelampsoraliniLTIR-NBS-LRRLUU27081Linumusitatissimum/MelampsoraliniMTIR-NBS-LRRU73916Nicotianatabacum/TMVNTIR-NBS-LRRQ40392Linumusitatissimum/MelampsoraliniPTIR-NBS-LRRDQ205351Arabidopsisthaliana/PeronosporaRPP1TIR-NBS-LRRAF098962Arabidopsisthaliana/PeronosporaRPP5TIR-NBS-LRRAAF08790Nicotianatabacum/FusariumI2NBS-LRRAF004878Nicotianatabacum/MeloidogyneMiNBS-LRRAF039681Hordeumvulgare/BlumeriaM1aNBS-LRRAY487937Oryzasativa/MagnaporthePi-taNBS-LRRAF207842Oryzasativa/MagnaporthePrfNBS-LRRAAC49408Nicotianatabacum/PseudomonasRp1NBS-LRRAF107294Zeamays/PucciniaRPM1NBS-LRRX87851Arabidopsisthaliana/PeudomonasRPP8/HRTNBS-LRRAF089710Hordeumvulgare/BlumeriaRPP13NBS-LRRAF209732Oryzasativa/MagnaportheRPS2NBS-LRRU12860Arabidopsisthaliana/PeudomonasRPS5NBS-LRRAF074916Solanumtuberosum/PVXRx2NBS-LRRAJ250405Nicotianatabacum/TospovirusSw-5NBS-LRRFJ686044Oryzasativa/XanthomonasXa1NBS-LRRAB002266Nicotianatabacum/CladosporiumCf-2/5LRR-TMAF053993Nicotianatabacum/CladosporiumCf-49LRR-TMY12640Nicotianatabacum/PseudomonasPtoLRR-TM-KinaseAF220603Oryzasativa/XanthomonasXa21UnrquecU37133pro-1Betavulgaris/HeteroderaHSlUnrquecU79733Arabidopsisthaliana/ErysipheRpw8UnrquecNM_113554Hordeumvulgare/BlumeriaMloMembiane/ProtenZ83834Zeamays/CochliobolusHmlToxinU774632.2.3RGA引物的设计19 海岛棉枯萎病抗性相关基因的克隆及功能验证利用生物信息学软件DNAMAN将所需要的基因序列文件的文件格式转换成后缀是“.seq”的文件，并重新命名，如“L.seq”。然后将所有重新命名后的文件导入软件PrimerPremier3.0中，进一步分析。按照引物设计的原则，具体考虑引物长度(primerlength)，产物长度(productlength)，序列Tm值(meltingtemperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性(internalstability，用△G值反映)，形成引物二聚体(primerdimmer)，发夹结构(duplexformationandhairpin)的能值，在错配位点(falseprimingsite)的引发效率，引物及产物的GC含量(composition)等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。本实验利用软件PrimerPremier3.0进行引物设计，参数设置是：引物长度为16-25bp，产物长度为100-500bp，GC含量为40%-60%。2.2.4RGA分析2+RGA引物的PCR反应体系为10μL，10×Buffer（含Mg）1µL，10mMdNTPs-1-10.2µL，2.5U·µLTaqDNA聚合酶0.2µL，1.0uM·µL正向和反向引物各1µL，-150ng·μL模板DNA1µL，ddH2O6.6µL。PCR扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性50s，55℃复性55s，72℃延伸60s，30个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物利用10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离分析（150V恒压），并使用快速银染法染色。2.2.5BSA(BulkedSegregantAnalysis)分池[101]参照Michelmore提出的BSA方法，结合F2单株田间病级，提取F2群体单株DNA，建立抗、感基因池。选取10株高抗（田间病级为0级）的F2单株DNA等量混合建成DNA抗病池，选取10株高感（田间病级为4级）的F2单株DNA等量混合建成DNA感病池，利用在双亲间筛选的多态性引物在抗、感基因池进行引物筛选。2.2.6BSA分池标记记录及数据分析利用抗病基因池和感基因池间中筛选到的差异引物在F2代单株里进行PCR20 新疆农业大学博士（硕士）学位论文扩增，并统计记录，分子标记谱带记录方法：共显性标记和母本带型一样的记为1，和父本带型相同的记为2，和F1带型相同的记为3；显性标记母本对父本显性时，和母本、F1带型相同的记为1，和父本带型相同的记为4；显性标记父本对母本显性时，和母本带型相同的记为5，和父本、F1带型相同的记为2，缺[102]失用“-”表示。按照Kosambi交换值与遗传距离的换算公式：x=1/4ln(1+2r/1-2r)(其中x表示遗传距离cM，r表示交换值），计算标记间的遗传距离。2.3结果与分析2.3.1RGA引物的设计通过NCBI核苷酸序列数据库查找分析得到28个与抗病性相关的基因（表2-1），共包含392条cDNA序列，它们在NBS结构域中均含有P-loop(GGVGKTT)、锚定区域、MHDV和GLPL(GLPLAL)保守基序(图2-1)。根据上述4个保守区域，利用软件PrimerPremier3.0，设计出107对RGA引物，且GC的平均含量在50%左右，退火温度在55℃左右，没有错配和引物二聚体的产生（表2-2），根据引物的来源，故命名为Gbrag1-Gbrag107。21 海岛棉枯萎病抗性相关基因的克隆及功能验证图2-1部分抗病基因的多重序列对比（氨基酸）Fig.2-1Partialmultiplesequencesalignmentofthedisease-resistantgenes（aminoacids）表2-2蕃茄青枯病抗性基因Pto的上下游引物的得分及其它情况Table2-2ThePto’sprimersupanddowntogetagoalandothercircumstancesooRatingSeqNoLengthTm[C]GC%G[kcal/mol]TaOpt[C]Sence1001312159.347.6-40.7Anti-Sence1005722151.042.9-35.8Product8644284.941.049.7Primersup5'TTGGGAAGGTTTACAAGGGTG3'(SeqNo:131)Primersdown5'ACTACTGTGCTAAGATGGGTT3'(SeqNo:572)注：TaOpt为退火温度Note:TheTaOptisbackfiretemperature2.3.2枯萎病病情田间调查及主要农艺形状的分析在棉花枯萎病的高发期即现蕾期和在收获期剖杆调查棉株的发病情况，图2-2和图2-3分别表示的是植株在现蕾期和剖杆期田间抗病性表现，图2-4和图2-5分别表示的是抗、感亲本植株在剖杆期田间抗病性表现。22 新疆农业大学博士（硕士）学位论文图2-2现蕾期植株抗病性表现。Fig.2-2performanceofdiseaseresistanceforcottonusingCuttingstemmethod图2-3剖杆期植株田间抗病性表现Fig.2-3performanceofdiseaseresistanceforcottonusingCuttingstemmethod图2-4剖杆期植株田间抗病性表现（父本）Fig.2-4performanceofdiseaseresistanceforcottonusingCuttingstemmethod(Maleparent)图2-5剖杆期植株田间抗病性表现（母本）Fig.2-5performanceofdiseaseresistanceforcottonusingCuttingstemmethod(Femaleparent)表2-3棉花主要农艺性状间的相关系数23 海岛棉枯萎病抗性相关基因的克隆及功能验证Table2-3Correlationonthemajoragronomiccharactersofthecotton株高果枝数病级单铃重单株成铃数单株重HeightNumberofDiseaseWeightofWeightNumberofbollofplantbranchesstagebollofplant株高1果枝数0.773**1病级-0.274**-0.328**1单铃重-0.102-0.04-0.1091单株成铃数-0.1540.159-0.139-0.0361单株重0.1830.154-0.1720.448**0.871注:数值旁的“*”和“**”分别表示相关显著和极显著。Note:Valueswith*or**indicatesignificantcorrelationatp=0.05or0.01level.由表2-3可以看出，果枝数、单株重与株高重呈显著正相关，说明这2个农艺性状对棉花增产具有极其重要的作用；病级、单铃重、单株成铃数与产量呈负相关。各主要性状与产量的相关系数由大到小依次为果枝数（r=0.773）、单株重（r=0.183）、单铃重（r=-0.102）、单株成铃数（r=-0.154）、病级（r=-0.274），表明在抗病育种的品种筛选及评价中更应该注重发病率及株高对产量的效应，宜选择发病率低、植株健壮的品种。因此表明单铃重、发病率在家系内不同基因型间存在显著差异。2.3.3RGA引物的多态性筛选用107对RGA引物对亲本进行多态性引物筛选，共筛选出12对多态性引物，多态性占11.12%。随后用这些具有多态性的引物对180个F单株做多态性2检测。图2-6RGA引物在两个亲本间的筛选Fig.2-6RGAprimerswerescreenedbetweenthetwoparents图2-7RGA标记的Gbrag55对F2代群体单株的PCR扩增Fig.2-7RGAmarkersGbrag55theF2populationsmonoclonalPCRamplification2.3.4RGA与枯萎病抗性的遗传连锁分析24 新疆农业大学博士（硕士）学位论文Gbrga14aGbrga14b图2-8RGA标记的Gbrga14PCR扩增Fig.2-8PCRamplificationofRGAmarkersGbrga14注：P1：抗病亲本；P2：感病亲本；RP：抗病池、SP：感病池Note:P1:theresistantparent;P2:thesusceptibleparent;RP:Resistancepool,SP:susceptiblepool利用RGA引物在两个亲本中筛选到的12对引物，分别于抗池、感池中再次筛选，最终获得1对引物Gbrga14，该引物在两池里扩增到明显不同的两个位点的带型，两个位点Gbrga14a、Gbrga14b扩增结果见图2-8。由图显示，抗病父本与抗池扩增结果一致，感病母本与感病池扩增结果一致。用Gbrga14标记与枯萎病基因间进行遗传连锁分析，F2单株中多数的抗病性单株和抗病父本一致，多数的感病性单株和感病母本一致（图2-9）。因此，初步推测Gbrga14是和海岛棉的枯萎病抗性密切连锁的标记。图2-9Gbrga14引物在F2代群体单株的PCR扩增Fig.2-9Gbrga14primerinF2populationsmonoclonalPCRamplification注：P1：抗病亲本；P2：抗病亲本；R：抗病单株、S：感病单株；-：缺失Note:P1:diseaseparents;P2:theresistantparent;R:resistantplants,S:susceptibleplants;-:missing由Gbrga14这个位点可知，与抗病父本扩增出一样带型的抗病单株共有91株，未扩增出的抗病单株有17个，缺失2个；与感病母本扩增出一样带型的抗病单株共有64株，未扩增出的抗病单株有4个，缺失2个。通过计算可知，分子标记Gbrga14与海岛棉枯萎病抗性的交换值为15.5%，遗传距离是15.92cM。2.3.5RGA引物的来源和结构通过对RGA引物来源的查找，由表2-4可以看出，根据拟南芥RPP5基因设计的引物有4对（占33.33%），分别是Gbrga14、Gbrga19、Gbrga21和Gbrga23；根据水稻Pib基因设计的引物有3对（占25%），分别是Gbrga25、Gbrga27和Gbrga55；根据棉花克隆的GhRGA-A5基因设计的引物有2对（占16.67%），分别是Gbrga325 海岛棉枯萎病抗性相关基因的克隆及功能验证和Gbrga8；根据亚麻L6基因设计的引物有2对（占16.67%）,分别是Gbrga24和Gbrga44；根据棉花克隆的GhRGA-D3基因设计的引物有1对（占8.36%），分别是Gbrga95；根据R基因的结构和功能，这12对在抗、感亲本及F2群体单株中具有多态性的RGA标记主要由3类组成，其中TIR-NBS-LRR类6对，占50%；NBS-LRR类5对，占41.67%；NBS类1对，占8.33%。由此说明这12对RGA引物是与抗病基因紧密连锁的标记。表2-412对RGA引物的来源和保守区Table2-412pairsofRGAprimersandconservedregionsofthesource引物名称引物来源保守区登录号PrimernamePrimeroriginConsevedregionsIDGbrga3Gossypiumhirsutum(GhRGA-A5)NBS-LRRFJ769805.1Gbrga8Gossypiumhirsutum(GhRGA-A5)NBS-LRRFJ769805.1Gbrga14Arabidopsisthaliana(RPP5)TIR-NBS-LRRAF180942.1Gbrga19Arabidopsisthaliana(RPP5)TIR-NBS-LRRAF180942.1Gbrga21Arabidopsisthaliana(RPP5)TIR-NBS-LRRAF180942.1Gbrga23Arabidopsisthaliana(RPP5)TIR-NBS-LRRAF180942.1Gbrga24Linum(L6)TIR-NBS-LRRU27081.1Gbrga25Oryza(Pib)NBS-LRRDQ317978.1Gbrga27Oryza(Pib)NBS-LRRDQ317978.1Gbrga44Linum(L6)TIR-NBS-LRRU27081.1Gbrga55Oryza(Pib)NBS-LRRDQ317978.1Gbrga95Gossypiumhirsutum(GhRGA-D3)NBSAF469105.12.4讨论已克隆的作物抗性基因的抗性机制是由于抗性基因产物和无毒基因产物互相作用，具有基因-基因模式的显著相关特性，比如诱导出来的过敏性反应等等。26 新疆农业大学博士（硕士）学位论文抗病基因都存在保守区域，在抗性反应信号的传导上是必须的。抗病基因的保守结构域NBS蛋白质是重要的抗性蛋白质，具有识别病原菌的功能。根据NBS的结构与功能域保守基序设计引物，可以使扩增产物涵盖到与抗病基因有关的区[103]域，提高了引物的分辨率。RGA分布于整个基因组中，通常其序列保守性程[104-105]度较高，可以保证有扩增产物。因此利用抗性基因的保守区域设计引物，然后进行PCR扩增，因此能够作为分子标记应用与作物辅助育种的工作中。若将RGA用作分子标记并整合到遗传连锁图谱上，或者把其当作基因文库的筛选，得到候选抗性基因，作为克隆抗性基因的方法不失为一条捷径。Donald等检测到3个抗病标记紧密连锁到葡萄抗白粉病RunI基因，其中2个（GLP1-12和MHD145）与之共分离。实验说明，RGA标记和BSA法紧密的结合，能够快速地产生与作物抗性紧密连锁的标记。根据此方法，本研究通过BSA法获得的与抗病基因紧密连锁的RGA标记Gbrga14，该标记是利用抗病基因的保守区域设计获得，属于LRR-NBS-TIR氨基酸保守结构域。Dixon等通过实验发现，LRR结构域中微小的修饰很容易破坏LRR的功能，LRR与病原Avr的成分和Avr信号在下游的传导成分互相作用是必须的，因此LRR的变异在破坏病原物的过程中有着[106]显著的影响。由此可以说明Gbrga14标记，是和棉花枯萎病紧密连锁的分子标记，是与枯萎病抗性相关的位点，为相关性状的遗传研究、主效基因发掘及标记开发提供了初步的参考依据。本研究获得12对与枯萎病抗病基因紧密连锁的RGA引物，通过对RGA引物来源的查找，根据拟南芥RPP5基因设计的引物有4对（占33.33%）；根据水稻Pib基因设计的引物有3对（占25%）；根据棉花克隆的GhRGA-A5基因设计的引物有2对（占16.67%）；根据亚麻L6基因设计的引物有2对（占16.67%）；根据棉花克隆的GhRGA-D3基因设计的引物有1对（占8.36%）；这12对具有多态性的RGA标记主要由3类组成，其中TIR-NBS-LRR类6对，占50%；NBS-LRR类5对，占41.67%；NBS类1对，占8.33%。这些结果表明利用RGA标记确定与枯萎病抗性基因紧密连锁的分子标记有利于抗病基因的克隆和抗病的分子标记辅助选择育种。27 海岛棉枯萎病抗性相关基因的克隆及功能验证许多抗病基因都具有核苷酸结合位点（NBS）和富亮氨酸重复区（LRR）。根据已知的NBS-LRR类抗病基因的保守序列，可以设计扩增引物并筛选出特异性引物，用以扩增棉花基因组中的抗病基因同源序列，经克隆测序后可以得到NBS-LRR类RGA。简桂良等利用上述方法，推导出其氨基酸均具有抗病基因的P-loop（kinase-1a）、kinase-2、kinase-3a及GLPL区，经同源性比较发现，TIR-NBS-LRR类RGA与已克隆的N、L6、M等抗病基因的同源性为51-60%，可以[107]作为分子标记筛选棉花的抗病候选基因。曹承忠采用AFLP和RGA两种分子标记技术对抗病近等位基因系209和杂25抗感杂交F2分离群体进行了DNA多态分析，结果表明RGA标记和AFLP标记的扩增结果基本一致，且RGA标记与表型交换率低于AFLP标记，也证明了RGA标记可作为筛选棉花抗枯萎病基因的更为有[108]效的分子标记。由此可见，RGA特异性引物的分子标记开发为选育优良的棉花抗枯萎病品种提供了理论基础和技术支持。第三章海岛棉枯萎病抗性相关基因的克隆与生物信息学分析植物的基因克隆是基因工程技术的重要组成部分。利用分子生物信息学方法，从海岛棉抗病、感病植物里克隆枯萎病抗性相关基因，将它转化到农作物里，获得抗病转基因植株是培育抗病植物新品种十分有利的方法。目前关于海岛棉抗病相关基因的分子机制方面的研究很少，本研究以第二章定位到的与抗病性紧密连锁的功能标记为基础，通过电子克隆技术从新疆海岛棉“06-146”中克隆枯萎病抗性相关基因cDNA的基因全长，并通过NCBI数据库和相应软件分析已克隆的基因及他们的蛋白序列，从而为进一步研究该基因的遗传和抗性功能鉴定奠定基础。3.1材料3.1.1实验材料28 新疆农业大学博士（硕士）学位论文海岛棉抗枯萎病品系“06-146”，海岛棉感枯萎病品种新海14号，大肠杆菌（E.coli）DH5α菌株为本实验室保存。3.1.2主要试剂和仪器T4DNA连接酶、限制性内切酶、克隆载体pMD18-T、DNAMarker100bp、DL2000、DL15000均为TaKaRa（大连）公司产品；琼脂糖凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；RNA提取试剂盒为北京天恩泽基因科技有限公司；cDNA第一链合成试剂盒购自Fermentas公司；引物合成、测序工作由北京华大六合基因公司完成；其余试剂均为国产分析纯。凝胶成像分析系统为ALPHA产品；PCR仪、高速冷冻离心机为Eppendorf产品；紫外分光光度计为UVProbe产品等。3.2方法3.2.1目的基因片段的分离通过BSA法确定标记Gbrga14是与海岛棉抗枯萎病紧密连锁的，以该标记引物扩增出的DNA序列为目的片段，对该目标片段进行回收测序。3.2.2同源序列克隆以测序后的基因片段序列为探针，对棉花EST数据库进行BLAST检索，获得与目标基因同源性较高的EST序列。将获得的EST序列进行拼接，获得新的延伸序列（Contig）。以获得的Contig反复对棉花EST数据库进行BLAST检索、拼接和延伸，直到不能延伸为止，尽可能获得全长cDNA。对最终获得的新生序列运用生物软件进行分析和引物设计。3.2.3总RNA的提取3.2.3.1器皿的处理RNA提取使用专用的一次性塑料器皿，实验中的玻璃器皿均用0.1%的DEPC（焦磷酸二乙酯）水溶液在37℃下处理12h之后，120℃高压灭菌30min以除去残留的DEPC。金属制品和研钵均在180℃烘箱中烘烤4h以上。3.2.3.2总RNA的提取29 海岛棉枯萎病抗性相关基因的克隆及功能验证使用北京天恩泽基因科技有限公司的ColumnPlantRNAOUT2.0离心柱式植物总RNA提取试剂盒提取海岛棉总RNA。具体步骤：取海岛棉叶片组织50mg在液氮中迅速研磨成粉末，移至干净的1.5mL塑料离心管中。在离心管中加入1mL的BufferA、300μL的BufferB和200μL自备氯仿，在振荡器上振荡30s混匀，室温12000rpm离心10min。将上清液（约600μL）转移到另一干净的1.5mL塑料离心管中，加入等体积的BufferC，充分颠倒混匀。将一半溶液转移到离心吸附柱中，12000rpm室温离心30s，弃穿透液，将剩下的一半溶液转移到同一离心吸附柱中，12000rpm室温离心30s，弃穿透液。在离心吸附柱中加700μL通用洗柱液，盖上盖后颠倒数次混匀。12000rpm室温离心30s，弃穿透液。再加300μL通用洗柱液到离心吸附柱中，12000rpm室温离心30s，弃穿透液，12000rpm室温离心2min。将离心吸附柱转移到RNase-free收集管中，加入50μLRNA洗-1脱液，室温放置5min。12000rpm室温离心30s，加入45μL4mol·LLiCl和600μL-12mol·LLiCl，-20℃放置2h，12000rpm离心10min，75％乙醇洗涤2-3次，室温晾干后加入30μLRNase-freedd·H2O，离心管中溶液即为RNA样品。所得RNA溶液可以立即使用或存放于-80℃待用。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。在紫外可见分光光度计上测定230、260和280nm的光吸收值，确定RNA的浓度及纯度。以260nm的OD值计算样品中RNA的浓度，用A260/A280和A260/A230的值评估RNA的纯度，纯RNA样品的A260/A280为1.7-2.0，A260/A230大于2.0。如果样品中有蛋白质、酚或多糖等杂质，其A260/A280和A260/A230的值将明显低于此值。按照1OD260约为40μg计算RNA浓度。3.2.4cDNA第一链的合成3.2.4.1特异性引物的设计根据电子克隆所得的全长cDNA序列，分别在起始密码子区域和终止密码子区域设计ORF全长特异性引物（表3-1）。表3-1引物及其预期片段大小Table3-1primersandpre-productionlength引物名称序列产物大小备注PrimerSequenceofprimersizeofNoteNameproduct(bp)30 新疆农业大学博士（硕士）学位论文RGBCH-orfF:ATGTTGAGATGTTGCATCCTTRGBCH全长765R:TCACAACTCTCCCCCACTTAAGRGBCHFull-lengthSGBCH-orfF:ATGTTGAGATGTTGCATCCTCGSGBCH全长765R:TCACAACTCTCCCCCACTTASGBCHFull-lengthM13-47CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC通用引物RV-MGAGCGGATAACAATTTCACACAGGConsensusprimer3.2.4.2cDNA第一链的合成以提取的海岛棉叶片总RNA为模板，利用Fermentas公司的RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit说明书进行cDNA第一链的合成。在小离心管中加入海岛棉总RNA5µL（50ng），Oligo（dT）Primer（50µM）1µL，dNTPMixture（10mM）1µL，并用RNaseFreeH2O加至10µL。混匀，65℃保温5min，迅速在冰上冷却TM2min以上。在上述混合物中加入5×PrimeScriptBuffer4µL，RNaseInhibitor-1TM-1（40UµL）1µL，PrimeScriptReverseTranscriptase（200UµL）1µL，RNaseFreeH2O加至20µL，混匀，42℃保温1h，70℃保温15min，冰上冷却，得到海岛棉cDNA用于PCR扩增。cDNA第一链合成后-20℃保存备用。3.2.4.3反应体系与PCR扩增分别以海岛棉品系“06-146”、新海14号的cDNA为模板，使用特异性引物进行基因的扩增。PCR反应体系为25μL：模板cDNA1μL，10×PCRBuffer2.5μL，-1-1primer（10μmol·L）2μL，dNTP（10mmolLeach）0.5μL，TaqDNA聚合酶-1(2.5UµL)0.4μL，ddH2O18.6μL。PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，58℃，50s，72℃，60s，反应30个循环；72℃延伸8min，4℃保存。3.2.5RGBCH和SGBCH基因的克隆3.2.5.1基因片段的分离与回收以上所有PCR产物均通过1.5%琼脂糖凝胶电泳进行分离并检测，之后在紫外灯下切下含有目的DNA片段的凝胶块。使用TianGen公司琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的DNA，具体步骤：向放有凝胶块的2mL离心管中加入3倍胶体积的溶胶液PN，50℃水浴放置10min，期间间断振荡混合离心管中的液体，使胶块充分融化。将所有液体转入安置于收集管上的DNA吸附柱CA2中，静置2min后12000rpm离心1min，弃滤液。向吸附柱CA2中加入600μL漂洗液PW，31 海岛棉枯萎病抗性相关基因的克隆及功能验证12000rpm离心1min，弃滤液并重复一次该步骤。将吸附柱CA212000rpm离心2min以出去吸附膜中残留的液体。将吸附柱安置于新的收集管上置于室温放着数分钟，彻底的晾干。向吸附膜中间位置悬空滴加30μL的洗脱缓冲液EB，室温静置5min后12000rpm离心2min收集DNA溶液。3.2.5.2连接、转化与测序将DNA回收片段连接到pMD18-T(TaKaRa)载体上，连接体系为10μL：目的片段(回收DNA)4μL，pMD18-T载体1μL，SolutionI5μL，混匀，离心使液体收集于管底，16℃连接过夜，之后转化大肠杆菌DH5α。大肠杆菌DH5α化学感受态的制备过程为：调取大肠杆菌DH5α单菌落于LB液体培养基(1%Trytone，0.5%YeastExtract，1%NaCl，pH7.0)中37℃过夜培养，取5mL菌液转接于含有50mL的LB液体培养基的三角瓶中37℃振荡培养，当菌液的OD600达到0.35-0.5左右时停止培养，将三角瓶冰浴10min，然后将菌液导入预冷的60mL无菌离心管中，12000rpm离心5min，弃尽上清。加入600μL-10.05mmol·LCaCl2溶液重悬浮细胞，12000rpm离心5min，弃上清并重复一次-1该步骤；向离心管中加入4mL含有15%甘油的0.05mmol·LCaCl2溶液，重悬浮细胞后以100μL每管的量分装于1.5mL无菌离心管中，液氮速冻后保存于-80℃。向100μL感受态细胞中加入10μL连接液，轻轻混匀。冰浴30min；42℃热激90s，立即转入冰浴中冷却3min。加500mLLB液体培养基，37℃震荡培养1h。-1取200μL菌液涂布于含浓度为100μg·mL氨苄青霉素的LB固体培养基上(1%Trytone，0.5%YeastExtract，1%NaCl，1.5%Agar，pH7.0)，37℃培养12-16h。+-1挑取白斑于LB(含Amp100μg·mL)液体培养基中培养，以通用引物M13-47/RV-M(表2-1)进行菌液PCR验证转化情况，把阳性克隆子送北京华大基因有限公司测序。3.2.6基因的序列分析3.2.6.1开放阅读框的查找和蛋白质翻译基因的完整开放阅读框(OpenReadFrame，ORF)的查找和翻译以及蛋白质的预测和分析均通过VectorNTI9软件完成。32 新疆农业大学博士（硕士）学位论文3.2.6.2序列的同源性分析NCBI上对基因的核酸和蛋白序列进行BLAST同源性检索；采用DNAMAN软件将克隆的基因与其它植物同源性较高的蛋白序列进行聚类分析。3.2.6.3蛋白质生物信息学分析基因序列的生物信息学分析利用Expasy提供的在线软件进行；用Protparam分析蛋白的氨基酸序列组成、相对分子质量、等电点等理化性质；用PROSCALE对蛋白质的亲疏水性进行分析；用SOPMA预测蛋白质的二级结构；利用TMHMM进行蛋白质跨膜区段预测；用PROSITE对蛋白质的保守基序(motif)和结构域进行分析。3.2.7功能基因标记转化根据RGBCH和SGBCH基因的差异序列部分，利用PrimerPremier5·0软件设计引物，并对供试亲本及F2群体和部分抗、感枯萎病材料进行验证。3.3结果与分析3.3.1RNA的提取与检测分别以海岛棉品系“06-146”、新海14号的叶片组织为材料进行总RNA提取，经1.5%琼脂糖凝胶电泳显示（图3-1），28S核糖体RNA与18S核糖体RNA的带型清晰锐利，无基因组DNA的污染。为进一步确定RNA质量，使用紫外分光光度计在波长230nm，260nm和280nm下测吸光度，得出A260/A230=2.08，A260/A280=1.92，说明此RNA完整性较好，纯度较高，不存在蛋白质、多糖和酚类物质的污染。因此，提取的RNA的质量和纯度符合实验要求，能够进行后续实验。注：1：海岛棉06-146的总RNA；2：新海14号的总RNA33 海岛棉枯萎病抗性相关基因的克隆及功能验证Note:1:TotalRNAofSeaIslandcotton06-146;2:TotalRNAofXinhai14图3-1海岛棉总RNA的提取Fig.3-1TotalRNAextractedofSeaIslandcotton3.3.2目的基因片段的获得利用引物Gbrga14对品系“06-146”、新海14号进行PCR扩增，找到该标差异性位点条带，对该位点条带进行回收，对阳性克隆子进行测序，获得两个目的基因片段，分别命名为RFW和SFW。图3-2RFW基因片段Fig.3-2ThefragmentofRFWgene图3-3SFW基因片段Fig.3-3ThefragmentofSFWgene3.3.3所获基因片段的克隆3.3.3.1RGBCH基因的电子克隆利用RFW基因片段作为探针，对棉花EST数据库进行BLAST检索，得到一个高度相似的EST序列DN759185，然后再以此序列作为探针，对棉花EST数据库进行检索，得到一条与DN759185同源性较高并有部分重叠的EST序列DN759101，利用ContingExpress软件进行拼接，最终获得一个全长为765bp的序列（图3-4）。通过ORFFinder软件在线预测，其具有完整的ORF（图3-5）。34 新疆农业大学博士（硕士）学位论文图3-4棉花RGBCH基因的cDNA序列及其推导的氨基酸序列Fig.3-4ThecDNAanddeducedamionacidsequenceofcottonRGBCHgene图3-5棉花RGBCH基因电子拼接cDNA序列的ORFFinder预测Fig.3-5ORFpredictionofcottonRGBCHcDNA3.3.3.2SGBCH基因的电子克隆利用SFW基因片段作为探针，对棉花EST数据库进行BLAST检索，得到一个高度相似的EST序列DN758994，利用ContingExpress软件进行拼接，以拼接序列在对棉花EST数据库进行BLAST检索，结果显示ORF区没有变动，Conting拼接完成，获得一个全长为765bp的序列（图3-6）。通过ORFFinder35 海岛棉枯萎病抗性相关基因的克隆及功能验证软件在线预测，其具有完整的ORF（图3-7）。图3-6棉花SGBCH基因的cDNA序列及其推导的氨基酸序列Fig.3-6ThecDNAanddeducedamionacidsequenceofcottonSGBCHgene图3-7棉花SGBCH基因电子拼接cDNA序列的ORFFinder预测Fig.3-7ORFpredictionofcottonSGBCHcDNA3.3.4基因克隆及序列分析3.3.4.1RGBCH、SGBCH基因的cDNA克隆以海岛棉品系“06-146”、新海14号的cDNA为模板，使用特异性引物进行PCR扩增反应，均得到765bp的完整ORF(图3-8)，均编码254氨基酸残基的蛋白。经BLAST分析发现这两个基因与已知的植物逆转录因子有着很高的相似性，命名为RGBCH和SGBCH（图3-9、图3-10），且序列不含内含子。用DNAMAN36 新疆农业大学博士（硕士）学位论文软件对RGBCH和SGBCH基因的氨基酸序列进行对比（图3-11），一致性分为95.67%，序列上的差异性可能导致了它们之间的功能不同。注：M：DNA分子量标准DL2000；1：RGBCHPCR产物；2：SGBCHPCR产物Note:M:DNAmarkerDL2000;1:amplifiedproductofRGBCHPCR;2:amplifiedproductofSGBCHPCR图3-8基因RGBCH、SGBCH的PCR扩增Fig.3-8PCRamplifiedresultsofRGBCH、SGBCH图3-9RGBCH基因的核苷酸序列Fig.3-9NucleotideofRGBCHgene图3-10SGBCH基因的核苷酸序列Fig.3-10NucleotideofSGBCHgene37 海岛棉枯萎病抗性相关基因的克隆及功能验证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图3-11RGBCH和SGBCH氨基酸序列比对Fig.3-11BlastanalysisbetweenamionacidsequenceofcottonRGBCHandSGBCH3.3.4.2RGBCH蛋白的生物信息学分析3.3.4.2.1RGBCH蛋白的理化性质RGBCH蛋白的物理化学特性用Protparam预测，该蛋白的分子式推测是C1353H2128N364O376S8，9.16是等电点，29766.4Da是相对分子质量；大约10h是原理推测半衰期，49.89是稳定数值，是不稳定的蛋白（稳定蛋白的准确值是40往下），该蛋白可能是个不太成熟的多肽，应该通过翻译以并加工后能形成稳定蛋白。在蛋白中相比含量偏多的氨基酸是Glu（26个，10.2%）和Leu（26个，10.2%），该蛋白中含量比较少的氨基酸是Cys（（3个，1.2%）。带正电荷的总体的残基（Arg+Lys）是43；带负电荷的总体的残基（Asp+Glu）是36。-0.467是亲水性平均数，推测该蛋白为亲水性的，主要在膜的表面，其脂肪指数87.83。图3-12RGBCH蛋白的疏水性/亲水性分析Fig.3-12Predictedhydrophobicity/hydrophilicforproteinRGBCH3.3.4.2.2RGBCH蛋白质二级结构预测DNASTAR软件预测RGBCH蛋白质的二级结构：利用DNASTAR软件的38 新疆农业大学博士（硕士）学位论文Garnier-Robson和Chou-Fasman方法预测棉花RGBCH蛋白二级结构。结果显示：Garnier-Robson法和Chou-Fasman法预测的RGBCH蛋白的二级结构是以α-螺旋为主，Chou-Fasman法预测RGBCH缺乏无规则卷曲结构。图3-13DNASTAR对RFW蛋白二级结构预测Fig.3-13PredictedsecondarystructureforproteinRFWbyDNASTARSOPMA二级结构预测：RGBCH蛋白包括4.33％的β-转角、14.96%的延伸链、43.7％的无规则卷曲和37.01％的α-螺旋。此蛋白二级结构的主要部分是α-螺旋。利用SOPMA软件在线分析显示：注：α-螺旋(h)、延伸链(s)、β-转角(t)和无规则卷曲(c)分别由蓝、红、绿和粉红线条表示Note:Theα-helix(h),extendedstrand(s),β-turn(t),andcoil(c)wereindicatedwithblue,red,green,andpinklines,respectively图3-14SOPMA对RGBCH蛋白二级结构预测Fig.3-14PredictionofthesecondarystructureofproteinRGBCHbySOPMA39 海岛棉枯萎病抗性相关基因的克隆及功能验证3.3.4.2.3RGBCH蛋白质跨膜区段预测RGBCH蛋白的蛋白质跨膜区段是利用TMHMMServerv.2.0软件进行预测，如图所示，RGBCH蛋白不存在跨膜区。图3-15RGBCH蛋白跨膜结构分析Fig.3-15TransmembranestructurepredictionoftheantiporterproteinRGBCH3.3.4.2.4RGBCH蛋白的信号肽分析RGBCH蛋白的N末端利用SignalP软件分析，显示此蛋白也许包含一段信号肽序列，位于29和30之间的氨基酸是信号肽切除位点，即酶切位点是SFQ-SS。通过隐马尔可夫模型预示着该蛋白是一种非分泌性蛋白。图3-16RGBCH蛋白信号肽分析Fig.3-16SignalpeptideanalysisoftheantiporterproteinRGBCH3.3.4.3SGBCH蛋白的生物信息学分析3.3.4.3.1SGBCH蛋白的理化性质SGBCH蛋白的物理化学特性用Protparam预测，该蛋白的分子式推测是C1356H2136N360O377S9，9.05是等电点，29802.6Da是相对分子质量；大约10h是原理推测半衰期，49.54是稳定数值，是不稳定的蛋白（稳定蛋白的准确值是40往下），该蛋白可能是个不太成熟的多肽，应该通过翻译以并加工后能形成稳定蛋白。在蛋白中相比含量偏多的氨基酸是Glu（27个，10.6%），该蛋白中含量比40 新疆农业大学博士（硕士）学位论文较少的氨基酸是Cys（（3个，1.2%）。带正电荷的总体的残基（Arg+Lys）是43；带负电荷的总体的残基（Asp+Glu）是37。-0.426是亲水性平均数，推测该蛋白为亲水性的，主要在膜的表面，其脂肪指数88.98。图3-17SGBCH蛋白的疏水性/亲水性分析Fig.3-17Predictedhydrophobicity/hydrophilicforproteinSGBCH3.3.4.3.2SGBCH蛋白质二级结构预测DNASTAS预测SGBCH蛋白质的二级结构：利用DNASTAS的Garnier-Robson和Chou-Fasman方法预测棉花SGBCH蛋白二级结构。结果显示：Garnier-Robson法和Chou-Fasman法预测的SGBCH蛋白的二级结构是以α-螺旋为主，Chou-Fasman法预测SGBCH缺乏无规则卷曲结构。图3-18DNASTAS对SGBCH蛋白二级结构预测Fig.3-18ProteinsecondarystructurepredictionoftheantiporterproteinSGBCHbyDNASTASSOPMA二级结构预测：RGBCH蛋白包括1.97％的β-转角、13.78%的延伸链、46.46％的无规则卷曲和37.8％的α-螺旋。此蛋白二级结构的主要部分是α-螺旋。注：α-螺旋(h)、延伸链(s)、β-转角(t)和无规则卷曲(c)分别由蓝、红、绿和粉红线条表示41 海岛棉枯萎病抗性相关基因的克隆及功能验证Note:Theα-helix(h),extendedstrand(s),β-turn(t),andcoil(c)wereindicatedwithblue,red,green,andpinklines,respectively图3-19SOPMA对SGBCH蛋白二级结构预测Fig.3-19PredictionofthesecondarystructureofSGBCHbySOPMA3.3.4.3.3SGBCH蛋白质跨膜区段预测RGBCH蛋白的蛋白质跨膜区段是利用TMHMMServerv.2.0软件进行预测，如图所示，SGBCH蛋白不存在跨膜区。图3-20SGBCH蛋白跨膜结构分析Fig.3-20TransmembranestructurepredictionoftheantiporterproteinSGBCH3.3.4.3.4SGBCH蛋白的信号肽分析SGBCH蛋白的N末端利用SignalP软件分析，显示此蛋白也许包含一段信号肽序列，位于29和30之间的氨基酸是信号肽切除位点，即酶切位点是SFQ-SS。通过隐马尔可夫模型预示着该蛋白是一种非分泌性蛋白。图3-21SGBCH蛋白信号肽分析Fig.3-21SignalpeptideanalysisoftheantiporterproteinSGBCH3.3.4.4RGBCH、SGBCH蛋白的功能预测及系统进化树的建立ProtFun预测RGBCH蛋白的主要功能是参与能量代谢和生物合成辅助因子；SGBCH蛋白的主要功能是参与蛋白质翻译过程中的能量转换。以上预测正好符合了病菌对棉株的侵染后，棉株激起一系列的生理生化反应，如植保素积累、酶类代谢加强等。将RGBCH、SGBCH的氨基酸序列进行BLAST比对后，我们发现与其同源的蛋白有很多，根据种属来源我们从中选出7条氨基酸序列，分别是籼稻的42 新疆农业大学博士（硕士）学位论文OSIGBa0102O13.1(CAH65910.1)，甜菜的Retrotransposonprotein(ABM55240.1)，甜瓜的Polprotein(AAO45752.1)，粳稻的Putativepolyprotein(AAV31295.1)，葡萄的HypotheticalproteinVITISV-016361(CAN69016.1)，马铃薯的Putativeintegrase（AAT39954.1）、Polproteinputative(ABI34389.1)，序列比对和构建系统发生树后发现，RGBCH与来自甜菜Retrotransposonprotein的逆转录转座子蛋白同源性最高（图3-22），表明它们二者可能功能较相似。SGBCH与来自马铃薯Polproteinputative的转录多聚蛋白同源性最高（图3-23），表明它们二者可能功能较相似。图3-22RGBCH氨基酸序列与其他物种同源序列的进化树分析Fig.3-22PhylogenetictreeofRGBCHandotherspices图3-23SGBCH氨基酸序列与其他物种同源序列的进化树分析Fig.3-23PhylogenetictreeofSGBCHandotherspices3.3.5功能基因标记的获得与验证根据RGBCH和SGBCH基因序列的差异部分，利用PrimerPremier3·0软件设计特异性引物，通过对两个供试亲本及F2群体进行的PCR扩增检测验证，如图3-24所示，F2抗病单株与抗病亲本的扩增结果基本一致；F2感病单株与感病亲本扩增结果基本一致。对海岛棉抗、感枯萎病资源品种进行PCR扩增检测，43 海岛棉枯萎病抗性相关基因的克隆及功能验证结果如图3-25所示。抗病资源品种与抗病亲本的扩增结果基本一致；感病资源品种与感病亲本扩增结果基本一致。正向引物：5’-CGCAGAAAATAGAAAGGG-3’反向引物：5’-GAGTTGTATGATTGTAACCGAG-3’图3-24供试亲本及F2群体的PCR扩增检测Fig.3-24PCRamplificationtestedparentsandF2populations图3-25部分海岛棉抗、感枯萎病品种PCR扩增检测PCR扩增检测Fig.3-25PCRamplificationforpartoftheislandcottonanti-senseofFusariumwiltvarieties3.4讨论本实验分别对RGBCH和SGBCH基因及其编码的蛋白质进行生物信息学分析，采用了多种方法进行预测，通过对多种二级结构预测结果进行比较分析，发现RGBCH蛋白含α-螺旋（37.01％）、β-转角（4.33％）、延伸链（14.96%）和无规则卷曲（43.7％）；SGBCH蛋白含α-螺旋（37.8％）、β-转角（1.97％）、延伸链（13.78%）和无规则卷曲（46.46％）；ProtFun预测RGBCH蛋白的主要功能是参与能量代谢和生物合成辅助因子；SGBCH蛋白的主要功能是参与蛋白质翻译过程中的能量转换。本章所进行的工作只是对新克隆的抗性相关基因及功能进行初步预测，功能预测对实验具有指导意义，但不能取代经典的转基因技术，对其基因功能的研究还需要转基因的功能鉴定得知。44 新疆农业大学博士（硕士）学位论文[109]雷江荣等人将来自拟南芥的SNC1基因通过农杆菌介导法转入棉花，然后接种棉花枯萎病菌，检测与抗病性有关的5类防御酶，发现酶活性变化差异明[110]显，同时发现其后代棉根茎部胼胝质、侵填体和胶质体形成多于非转基因棉，[111]并且韧皮部细胞排列紧密，规整，细胞间隙小，利于抵御外来病原物侵害。结果发现，拟南芥中的病程相关基因非表达子1(nonexpressorofpathogenesis-relatedgenesl，NPRI)基因是植物抗病反应中的一个关键调控基因。它不仅对植[112][113]物SAR和ISR起核心调控作用，而且是植物基础抗性(basicresistance)以及[114]由抗病R基因决定的抗性的重要调控因子。NPRI通过与TGA转录因子的相[115]互作用调控PR基因的表达。NPRI植物防卫反应的不同形式的防御信号转导通路的交叉点是一个重要因素，是调节植物整体抗病性的重要因子，它与某些WRKY转录因子和NPR4(与NPRI类似)一起，在调节和平衡SA和JA信号传导[116]途径中起关健作用。研究表明，在许多植物中都存在NPRI的同源基因，目前已从烟草、番茄、水稻、玉米、甜菜、辣椒等植物中克隆了NPRI的同源基因[117][118]。因此，NPRI介导的抗性途径可能是多种植物共同保守的途径，并具有[119]广谱抗病作用。本文中我们根据棉花枯萎病抗性紧密连锁的分子标记的位点，运用电子克隆的方法，筛选出了棉花枯萎病的一个新的抗性相关基因RGBCH。BLAST比对显示与RGBCH基因高度同源的来自甜菜的逆转座子蛋白毗邻NPR1[120]基因，而NPR1是植物系统获得性抗性（SAR）中的一个关键基因，我们推测RGBCH可能与植物免疫有关。随着各种标记技术的成功发掘和利用，通过与抗病基因紧密连锁的分子标记辅助选择技术，为进一步提高棉花育种选择效率和准确性提供了可能。分子标记技术的应用仅取微量叶片或其它组织DNA即可，不会受到生育期和生育季节或者其它外面环境条件的干扰，研究技术快速简单。不过，普通的引物大多数不是来自于基因序列，引物和目的基因之间的连锁关系因为重新组合而被打破，致使[121]目的基因的选择并不完全可靠。因此，根据抗、感基因本身的DNA序列建立基因的功能标记，才是保证分子标记辅助选择完全准确无误的根本途径。本研究根据RGBCH和SGBCH基因DNA序列中存在碱基差异的特点，围绕差异区域45 海岛棉枯萎病抗性相关基因的克隆及功能验证400-500bp范围的序列设计出功能标记，利用这个标记检测分析仅需使用1对引物进行PCR反应即可初步区分抗病、感病基因型。与Bradury等研究的“等位基因特异扩增分析法”是要两组标记引物相比，在合成引物和点样方面显然更加[122]简便。第四章枯萎病抗性相关基因的组织特异性表达分析实时荧光定量PCR是具有灵敏度高、精确、扩增产物不用电泳检验等优点，是最近几年发展起来检测基因表达量的一种技术。不仅能够节约时间，并且能防范溴化乙锭(EB)对实验室里的污染，普遍应用于农作物的转基因技术及基因表达[123-124]量验证里，如大豆转基因成分的检测，植物DNA混合物中物种成分分析[125][126]，转基因玉米检测等。利用第三章的实验，我们经过克隆获得两条海岛棉枯萎病抗性相关基因RGBCH和SGBCH全长序列，我们应用SYBRGreenI实时定量PCR技术，检测RGBCH和SGBCH基因在棉花经过枯萎病病原菌诱导后，分析它们的表达量随不同棉花品种、不同组织器官和时间不断变化的差异表达，明确RGBCH和SGBCH基因的功能与海岛棉抗病性的关系。4.1材料4.1.1实验材料海岛棉抗枯萎病品系“06-146”，海岛棉感枯萎病品种新海14号，陆地棉46 新疆农业大学博士（硕士）学位论文抗枯萎病品种中棉所35号，陆地棉感枯萎病品种军棉1号，陆地棉遗传标准系TM-1，生理小种7号致病力中等的枯萎病菌株为本实验室保存。4.1.2主要试剂和仪器RNA提取试剂盒为北京天恩泽基因科技有限公司；cDNA第一链合成试剂盒购自Fermentas公司；荧光定量PCRSuperRealPreMix(SYBRGreen)购自天根生化科技(北京)有限公司；引物合成、测序工作由北京华大六合基因公司完成；其余试剂为国产分析纯。高速冷冻离心机（Eppendorf）；LightCycler2.0荧光定量PCR仪（罗氏）等。4.2方法4.2.1总RNA的提取及cDNA合成参见3.2.1.2和3.2.3.2。4.2.2棉种处理挑选饱满的棉种进行催芽处理，用75%的乙醇冲洗3次，30%的双氧水浸泡4-5h后，用无菌水反复洗涤3遍，将棉种放置在铺有无菌滤纸的培养皿中，[127-128]在恒温培养箱中28℃下保湿培养，待种芽长度达到1cm时播种。4.2.3棉苗的培育将催芽后的棉花种子种植在灌满清水的大塑料钵中，每个品种50株，待第2片真叶展平时接菌。4.2.4菌种的准备将冷藏保存的供试枯萎菌菌株接种在固体PDA（马铃薯50g，葡萄糖5g，链霉素0.1g，琼脂粉4.5g，蒸馏水定容至1000mL）培养基平板上进行菌株的活化，5d后在长满菌丝的平板上用打孔器打孔，挑取5-6块菌丝块放在液体PDA培养基中。在26℃下静置培养3d后，挑取液体培养基表面的菌丝，转接到营养较少的液体PDA培养基中，放在120rpm、26℃的恒温震荡培养箱中培养。7d7后用4层纱布过滤，在显微镜下用血球计数板将各菌株的孢子浓度调至2×107个·mL-3×10个·mL，孢子悬液现配现用。47 海岛棉枯萎病抗性相关基因的克隆及功能验证4.2.5棉苗接种77菌液浇根法：在每个塑料钵中灌入30mL浓度调至2×10个·mL-3×10个·mL的孢子悬液进行病原菌的诱导，以灌入等量无菌蒸馏水的棉苗做对照。4.2.6棉花总RNA的提取及cDNA合成待第2片真叶展平时，用枯萎菌孢子悬浮液进行诱导，分别在0d，2d，4d，6d，8d，10d，12d取叶片、下胚轴（茎）、根三个组织器官，分别提取总RNA，由于RNA含量少，在提取植物RNA时，样本量加倍（约0.2g研磨），紫外分光光度法测含量以定量总RNA，分别反转录得到cDNA，提取总RNA和反转录方法见3.2.1.2。4.2.7荧光定量特异性引物的设计本研究利用两种引物，根据RGBCH和SGBCH基因的差异序列部分设计特异性引物GBCH-Q；根据发表的抗黄萎病基因StVe(AY311527)设计特异性引物StVe-Q。引物序列见表4-1。表4-1特异性引物序列Table4-1Thesequenceofspecificprimers引物名称序列备注PrimerNameSequenceofprimerNoteGBCH-QF:CGCAGAAAATAGAAAGGG根据RGBCH和SGBCH基因的差异R:GAGTTGTATGATTGTAACCGAG序列部分设计特异性引物StVe-QF:ATGACACCGAAGACGAC根据发表的抗黄萎病基因StVe设计R:GAAAAGAAATGAGGGAT特异性引物4.2.8抗性相关基因表达分析采用荧光定量PCR分析五种材料在枯萎菌病原菌诱导下的抗性相关基因表达情况。SYBRGreenI实时荧光定量PCR20μL反应体系：SYBRprimeExTag-19μL，上下游引物各0.5μL(10μmol·L)，cDNA2μL，ddH208μL。稀释cDNA100倍后进行待测材料及内参基因GAPDH的SYBRGreenI实时定量PCR反应，反应体系加入毛细管后使用LightCycler2.0仪器进行PCR扩增。反应条件为95℃10sec，95℃5sec，55℃10sec，72℃20sec。设置温度改变速率均为20℃／S，循环55次。制备标准曲线并检测扩增效率。以GAPDH基因为参照基因，检测“06-146”，新海14号，中棉所35号，军棉1号，TM-1中与枯萎病抗性相关基48 新疆农业大学博士（硕士）学位论文因的表达水平，以0d样本为校准样本，2-12d样本为待测样本，每个样本重复三-△△Ct次，比较待测基因的表达差异，利用2进行相对定量分析：△Ct0时=0时待测基因Ct值-GAPDH基因Ct值△Ct待测样本=待测样本基因Ct值-GAPDH基因Ct值△△Ct=△Ct待测样本-△Ct0时—△△Ct—△Ct待测样本—△Ct02=2，结果绘制成柱状图。4.3结果与分析4.3.1不同组织器官的表达分析分别以“06-146”，新海14号，中棉所35号，军棉1号，TM-1的叶片、下胚轴（茎）、根三部分组织为材料进行总RNA提取，经1.5%琼脂糖凝胶电泳显示（图4-1），28S核糖体RNA与18S核糖体RNA的带型清晰锐利，无基因组DNA的污染。说明此RNA完整性较好，纯度较高，不存在蛋白质、多糖和酚类物质的污染，因此，提取的RNA的质量和纯度符合实验要求，能够进行后续实验。采用RT-PCR方法对该基因的转录水平进行了分析，研究棉花抗性相关基因的组织器官表达特异性。结果表明，在没有任何外界因素诱导的情况下，目的基因在棉花的叶、下胚轴、根中都有表达，但表达量不同，在下胚轴和根中的表达量相当，均高于叶片中的表达量（图4-2）。在没有任何外界因素诱导的情况下，该基因的表达量高于管家基因GAPDH的表达量（4-3）。图4-1棉花根、茎、叶总RNAFig.4-1ThecottontatolRNAofRoot，stemandleaf49 海岛棉枯萎病抗性相关基因的克隆及功能验证图4-2棉花抗性相关基因组织表达分析（管家基因）Fig.4-2Theresistancerelated-geneofcottonexpressionoftissueOrgan(House-keepinggenes)图4-3棉花抗性相关基因组织表达分析（特异性基因）Fig.4-3Theresistancerelated-geneofcottonexpressionoftissueOrgan(Specificgene)4.3.2实时荧光定量熔解曲线五种实验材料的幼苗经枯萎病病原菌诱导后，在0、2、4、6、8、10和12d内分别提取总RNA后，按天根荧光定量试剂盒说明书所述进行Real-timePCR，扩增后进行熔解曲线分析，结果见图4-4。从熔解曲线看出，目标基因RGBCH、SGBCH和参照基因GAPDH的PCR扩增产物分别在83.8℃、85.5℃和83.5℃达到峰值，无非特异产物和引物二聚体，整个实验过程没有污染，目标基因和参照基因表达稳定。图4-4RGBCH、SGBCH和参照基因GAPDH熔解曲线Fig.4-4MeltingcurvesanalysisofRGBCHgene、SGBCHgeneandGAPDHgene4.3.2枯萎病病原菌诱导下五种材料叶片组织的实时荧光定量分析4.3.2.1利用引物GBCH-Q进行荧光定量分析以GAPDH基因为内参基因，分别利用特异性引物GBCH-Q进行荧光定量PCR分析五个品种叶片组织的抗性相关基因在枯萎病病原菌诱导下的表达量。50 新疆农业大学博士（硕士）学位论文结果显示（图4-5），品系“06-146”的目的基因0d时就有表达，随着时间的变化，在4d和10d表达量增加，尤其是在10d达到最高，随后开始下降，到12d的表达量略少于0d；新海14号的目的基因在病菌诱导条件下，在6d时出现一个最高峰，其他时间的表达量基本相同，与0d时没有改变；中棉所35号、军棉1号和TM-1的目的基因在诱导前和诱导后表达量均很微弱，没有随着诱导时间的变化而呈现表达变化状态。图4-5五个材料的抗性相关基因在病菌诱导下的相对比率（叶片）Fig.4-5Theexpressionofthefivematerialsresistantgene(Leaves)51 海岛棉枯萎病抗性相关基因的克隆及功能验证4.3.2.2利用引物StVe-Q进行荧光定量分析以GAPDH基因为内参基因，分别利用引物StVe-Q进行荧光定量PCR分析五个品种叶片组织的抗性相关基因在枯萎病病原菌诱导下的表达量。结果显示（图4-6），品系“06-146”、新海14号、中棉所35号、军棉1号和TM-1的目的基因在病菌诱导条件下，0d时就有表达，随着时间的变化，并没有出明显表达量上升的情况。图4-6五个材料的抗性相关基因在病菌诱导下的相对比率（叶片）Fig.4-6Theexpressionofthethefivematerialsresistantgene(Leaves)52 新疆农业大学博士（硕士）学位论文4.3.3枯萎病病原菌诱导下五种材料下胚轴组织的实时荧光定量分析4.3.3.1利用引物GBCH-Q进行荧光定量分析表达结果显示（图4-7），品系“06-146”的目的基因0d时略有表达，处理2d后表达量逐渐增加，处理4d时达到表达高峰期，随后的12d该基因的表达量有所下调；新海14号的目的基因2d后表达量也逐渐增加，处理6d时达到表达高峰期，2d、4d、10d、12d表达量基本一致，略高于0d；中棉所35号、军棉1号和TM-1的目的基因在不同诱导时间的表达量一致，不受诱导时间的调控。品系“06-146”、新海14号的目的基因在诱导条件下不同诱导时间对该基因的表达量产生明显影响。由此可知，品系“06-146”、新海14号在遭受短时间枯萎菌诱导时表达量受胁迫诱导时间调控。53 海岛棉枯萎病抗性相关基因的克隆及功能验证图4-7五个材料的抗性相关基因在病菌诱导下的相对比率（下胚轴）Fig.4-7Theexpressionofthethefivematerialsresistantgene(Hypocotyl)4.3.3.2利用引物StVe-Q进行荧光定量分析以GAPDH基因为内参基因，分别利用引物StVe-Q进行荧光定量PCR分析五个品种叶片组织的抗性相关基因在枯萎病病原菌诱导下的表达量。结果显示（图4-8），品系“06-146”、新海14号、中棉所35号、军棉1号和TM-1的目的基因在病菌诱导条件下，0d时就有表达，随着时间的变化，并没有出明显表达量上升的情况。54 新疆农业大学博士（硕士）学位论文图4-8五个材料的抗性相关基因在病菌诱导下的相对比率（下胚轴）Fig.4-8Theexpressionofthethefivematerialsresistantgene(Hypocotyl)4.3.4枯萎病病原菌诱导下五种材料根组织的实时荧光定量4.3.4.1利用引物GBCH-Q进行荧光定量分析如图4-9显示，品系“06-146”的目的基因在处理4d时达到表达高峰期，新海14号的目的处理6d时达到表达高峰期；中棉所35号、军棉1号和TM-1的目的基因在不同诱导时间的表达量基本一致，但是略有差异，TM-1的表达量略低于中棉所35号、军棉1号。相比叶片和下胚轴的表达情况，不同材料的根组织表达情况均高于其他组织，这个可能与枯萎菌首先感染根部有关，在感染根组织中的生长素水平会有所改变，也有可能枯萎菌也参与了表达。55 海岛棉枯萎病抗性相关基因的克隆及功能验证图4-9五个材料的抗性相关基因在病菌诱导下的相对比率（根）Fig.4-9Theexpressionofthethefivematerialsresistantgenein(Root)4.3.4.2利用引物StVe-Q进行荧光定量分析以GAPDH基因为内参基因，分别利用引物StVe-Q进行荧光定量PCR分析五个品种叶片组织的抗性相关基因在枯萎病病原菌诱导下的表达量。结果显示（图4-10），品系“06-146”、新海14号、中棉所35号、军棉1号和TM-1的目的基因在病菌诱导条件下，0d时就有表达，随着时间的变化，并没有出明显表达量上升的情况。56 新疆农业大学博士（硕士）学位论文图4-10五个材料的抗性相关基因在病菌诱导下的相对比率（根）Fig.4-10Theexpressionofthethefivematerialsresistantgene(Root)4.4讨论诱导抗性是植物抗病主要表现，植物防卫反应相关转录因子的转录活性受病[129-130]原菌或激发子的调控，具有调控防卫反应途径的功能。因此，经过相应的外部条件处理后，基因表达水平通过早期的变化状态验证，最先检测出的是在防57 海岛棉枯萎病抗性相关基因的克隆及功能验证卫反应中可能拥有操控作用的功能基因，然后，通过对这些候选基因深入的功能研究，再深层分析检测。目前，尤其是迅速增加的基因组和EST等数据，此途[131]径已成为挖掘功能基因的一个重要策略。在棉花幼苗期枯萎病菌首先侵入的是根部，由主根的伤口或者侧根侵入，分生孢子在导管里产生并借助维管束往上延伸。因此，最早感受到病菌侵染的组织是棉花的根，这也是对病菌侵入最早表现出反应的组织。选择根为样本来进行实验，有助于发现在病菌侵入早期发挥功能的抗病相关基因，由此可以提高实验的准确性。高等植物在遇到外界环境胁迫或在病原菌侵染、化学药剂、激素、创伤[132-133]等的刺激下都将诱导基因的特异表达。但验证诱导基因表达的基础条件是具有一套可行的诱导体系，本实验采用的是高速、稳定的水培棉花接种体系——苗期孢子悬浮液浸根法。该方法培育的棉苗根部鲜嫩，发病很快，不用伤根接种，可以不用产生由外部因素对寄主造成的非目标性诱导的影响，并且取样的时间点相对紧密，这些也为获得病菌诱导表达的抗病相关基因奠定了相应的基础。病原菌对寄主开始侵染时，寄主会用相应的方法抵御病菌的侵入和延伸。Caitriona通过分析棉花经过诱导后的下胚轴和根的表达量，发现在4d时表达量明显增加，而且病原菌的侵入感染根和下胚轴组织，不同的基因反应与防御[134]相关基因的诱导下胚轴中，主要是感染根组织构。本实验室用枯萎病菌诱导五种不同品种的棉花幼苗，然后对它们的抗性相关基因表达水平进行实时荧光定量分析，为筛选枯萎病抗性相关基因提供合理快速的途径方法。通过对棉花叶片、下胚轴、根三种不同组织部位的研究，我们推测，在枯萎菌诱导后，由于病原菌侵染，导致棉花相关基因的表达量发生变化。在枯萎菌诱导棉花后，品系“06-146”是海岛棉抗性品种，枯萎病抗性相关基因被启动，表达出抗性蛋白。而新海14是感病品种，对枯萎菌敏感，易受感染，故在枯萎菌侵染一段时间后才做出反应。而中棉所35号、军棉1号、TM-1是陆地棉，大部分陆地棉对枯萎菌具有抗性，因此表达量相对较低。通过利用特异性引物GBCH–Q材料的荧光定量PCR分析可知：品系“06-146”目的基因的不同组织的表达量在根、下胚轴中4d时达到峰值，在叶58 新疆农业大学博士（硕士）学位论文片中4d时出现一个高峰，10天时再次出现一个高峰；新海14号的目的基因在6d时出现一个最高值，但表达量均低于“06-146”，这一峰值在8d即开始下降，随后降低到最初水平；中棉所35号、军棉1号和TM-1在诱导前和诱导后表达量均很微弱或者比较一致，基本维持在低水平表达，由此表明上述三个材料的抗性相关基因在病原菌侵入植株体内时没有做任何的防御，与抗病性并不相关；通过利用引物StVe-Q对材料的荧光定量PCR分析可知：品系“06-146”、新海14号、中棉所35号、军棉1号和TM-1的目的基因在病菌诱导条件下，0d时就有表达，随着时间的变化，并没有明显表达量上升的情况。由此可以看出本实验克隆出来的RGBCH和SGBCH基因在海岛棉防御病原菌的侵入时活化，从而抗御病原体的侵染。中棉所35号、军棉1号和TM-1品种内抗病基因不活化，细胞不合成抗病因子；也可能病原体产生的抑制物直接抑制抗病的基因的表达。预示着海岛棉和陆地棉枯萎病抗性机制可能不同。实验结果表明五种材料的根部组织的表达量均高于叶片、下胚轴组织，这个可能与枯萎菌首先感染的根部有关，在感染根组织中的生长素水平会有所改变，也有可能枯萎菌也参与了表达。第五章新疆海岛棉枯萎病抗性相关基因植物表达载体的构建和转基因植株的获得及抗性鉴定59 海岛棉枯萎病抗性相关基因的克隆及功能验证在植物基因工程技术中，由农杆菌介导的转化系统是一种天然有效的遗传转化系统，因其具有转化效率高、转化机理较清楚、以及转化的外源DNA基因结构完整和多为单拷贝等优点，在植物转基因技术中得到广泛的应用。叶盘法转化是用农杆菌感染叶片外植体并短期共培养。在培养过程中，农杆菌的vir基因被诱导，它的活化可以启动T-DNA向植物细胞的转移。共培养后，进行转化的外植体的筛选、愈伤组织的培养、诱导分化等步骤，以得到再生植株。叶盘法由于不需进行原生质体操作等，方法简单，获得转化植株也更快，是用植物外植体为材料进行转基因的一个良好途径。作为植物基因工程研究的模式植物，烟草是进[135]行转基因研究最早，也是转基因种类较多的经济作物。本研究利用已经克隆的RGBCH和SGBCH基因构建植物表达载体，并通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草，获得转RGBCH和SGBCH基因的烟草植株，为验证RGBCH和SGBCH基因功能打下基础。5.1实验材料5.1.1材料烟草无菌组培苗、转RGBCH和SGBCH基因烟草T1代种子及同样组培后收获的非转基因烟草种子。大肠杆菌（E.coli）DH5α、植物表达载体pCAMBIA1301、根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）EHA105、生理小种7号致病力中等的枯萎病菌菌株为本实验室保存。5.1.2试剂琼脂糖凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒为北京天根生化科技有限公司产品；T4DNA连接酶、限制性内切酶XbaⅠ和BamHⅠ、pMD18-Tsimple载体、DL2000、DL15000Makrer均为TaKaRa公司产品；cDNA第一链合成试剂盒购自Fermentas公司；引物合成、测序工作由北京华大六合基因公司完成；其余试剂均为国产分析纯。5.2实验方法5.2.1RGBCH、SGBCH基因编码区的克隆60 新疆农业大学博士（硕士）学位论文分别根据RGBCH、SGBCH全长基因序列设计特异引物：（分别带有XbaⅠ和BamHⅠ酶切位点），以第三章中获得的全长cDNA为模板，进行PCR，扩增出RGBCH、SGBCH基因的ORF编码区。采用25μL体系：模板cDNA1μL，-1-110×PCRBuffer2.5μL，primer（10μmol·L）2μL，dNTP（10mmolL）0.5μL，-1TaqDNA聚合酶(2.5UµL)0.4μL，ddH2O18.6μL。PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，60℃50s，72℃60s，反应30个循环；72℃延伸8min，4℃保存。表5-1试验所用引物列表Table5-1Listofprimersusedinthisexperiment引物名称引物序列备注PrimerNameSequenceofprimerNoteRGBCH-X-FGCTCTAGAATGTTGAGATGTTGCATCCTT含XbaI、BamHI酶切RGBCH-B-RCGGGATCCTCACAACTCTCCCCCACTTAAG位点引物SGBCH-X-FGCTCTAGAATGTTGAGATGTTGCATCCTCG含XbaI、BamHI酶切SGBCH-B-RCGGGATCCTCACAACTCTCCCCCACTTA位点引物5.2.2pCAMBIA1301-RGBCH、pCAMBIA1301-SGBCH植物表达载体的构建将上步目的片段首先连接到克隆载体pMD18-Tsimple上，构建中间重组质粒pMD18-T/RGBCH、pMD18-T/SGBCH，再用XbaⅠ和BamHⅠ对其双酶切，得到两端具有粘性末端的目的基因，并和同样酶切的pCAMBIA1301空载体相连，转化大肠杆菌DH5α，经卡那霉素（Kan）筛选后，挑取生长良好的克隆进行PCR检测和酶切鉴定。最后构建的植物表达载体命名为pCAMBIA1301-RGBCH、pCAMBIA1301-SGBCH。其技术路线见图5-1。61 海岛棉枯萎病抗性相关基因的克隆及功能验证图5-1植物表达载体pCAMBIA1301-RGBCH构建图Fig.5-1ConstructiononplantexpressionvectorofpCAMBIA1301-RGBCH5.2.3pCAMBIA1301-RGBCH、pCAMBIA1301-SGBCH植物表达载体的酶切和测序鉴定分别将pCAMBIA1301-RGBCH、pCAMBIA1301-SGBCH用XbaⅠ和BamHⅠ内切酶体系进行酶切验证，并进行测序鉴定。体系为：质粒8μL，灭菌去离子水9μL，XbaⅠ1μL，BamHⅠ1μL，10×KBuffer1μL，37℃培养箱静置反应3-4h。将经过酶切验证的载体再送到北京华大基因有限公司进行测序。5.2.4根癌农杆菌EHA105感受态的制备按照《分子克隆实验指南》（第3版）介绍的步骤进行。5.2.5pCAMBIA1301-RGBCH、pCAMBIA1301-SGBCH转化EHA105按照《分子克隆实验指南》（第3版）介绍的步骤进行。5.2.6根癌农杆菌中植物表达载体的检测-1-1挑取YEB固体培养基（含50mgL的Rif和50mgL的Kan）上长出的单-1-1个菌斑，于YEB液体培养基（含50mgL的Rif和50mgL的Kan）28℃下200rpm62 新疆农业大学博士（硕士）学位论文摇床上培养约48h。用质粒提取试剂盒从菌液中提取质粒用于电泳和PCR检测。-1扩增目的基因RGBCH和SGBCH序列。采用25μL体系，1mgL模板DNA，-1-110×PCRBuffer2.5μL，primer（10μmol·L）2μL，dNTP（10mmolL）0.5μL，-1TaqDNA聚合酶(2.5UµL)0.4μL，ddH2O18.6μL。PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，58℃50s，72℃60s，反应30个循环；72℃延伸8min，4℃保存。5.2.7培养基按照《分子克隆实验指南》（第3版）介绍的培养基配方进行配置。5.2.8转基因烟草的培育方法5.2.8.1农杆菌感受态细胞的制作同5.2.45.2.8.2重组表达载体pCAMBIA1301质粒的提取质粒DNA的提取采用北京天根生化科技有限公司生产的小量质粒DNA提取试剂盒（离心柱型）提取，提取过程严格按照说明书进行。提取后吸取5μL0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。5.2.8.3根癌农杆菌感受态细胞的转化将200μLEHA105感受态细胞，在冰上溶解，均匀悬浮，加入5μL重组表达载体pCAMBIA1301质粒DNA，轻轻混匀。迅速放置于液氮中处理5min。从液氮中取出后，迅速放置于37℃水浴锅中水浴5min。加入800μLYEB液体培养基，28℃、250rpm，培养4-5h。10000rpm离心30sec，去掉800μL上清后重悬菌体。-1-1涂布于含YEB+50mgLKan+50mgLRif平板上，倒置28℃培养36-48h。5.2.8.4菌液PCR鉴定（1）PCR模板制备：从转化平板上随机挑取EHA105白色单菌落，在装有5mL-1-1LB+50μgmLKan+50μgmLRif的10mL离心管中，28℃培养36-48h。将每管进行编号，每管取100μL培养物用于菌液PCR。剩余4900μL培养物保存于4℃。（2）PCR反应体系及扩增程序：模板DNA1μL，10×PCRBuffer2.5μL，primer-1-1-1（10μmol·L）2μL，dNTP（10mmolLeach）0.5μL，TaqDNA聚合酶(2.5UµL)63 海岛棉枯萎病抗性相关基因的克隆及功能验证0.4μL，ddH2O18.6μL。PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，57℃50s，72℃60s，反应30个循环；72℃延伸8min，4℃保存。PCR扩增后1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。5.2.8.5质粒PCR鉴定（1）质粒提取：菌液PCR鉴定呈阳性的剩余4900μL菌液吸取3000μL提取质粒，采用北京博大泰恒生物有限公司生产的质粒小量提取试剂盒（离心柱型）提取，提取过程严格按照说明书进行。提取后吸取5μL经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。（2）PCR反应体系及程序：PCR反应体系及程序与4.2.2.5PCR反应体系及程序相同。PCR扩增后经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。5.2.8.6农杆菌菌株准备将已转化表达载体的农杆菌单菌落接种于5mLYEB（已加入Kan和Rif，浓度-1均为50mgL）培养基中，28℃、250rpm培养36-48h。取lmL菌液于50mLYEB-1（已加入Kan和Rif，浓度均为50mgL）中，28℃放大培养至OD600=0.5-0.8。将菌液装入50mL无菌离心管中，4℃5000rpm离心5min收集菌体，去上清。用无-1菌水重悬，洗去抗生素，4℃10000rpm离心1min，去上清。加入50mLMS+2mgL-16-BA+0.1mgLNAA（液体），悬浮菌体，备用。5.2.9农杆菌介导的烟草遗传转化方案（1）预培养：取顶部充分伸展的45d苗龄的烟草无菌苗叶片为外植体，用刀切成约0.5cm×0.5cm的小方块，远轴面向上，近轴面向下放置于MS固体培养基上，25-26℃暗培养3d。（2）侵染：将预培养3d的烟草叶片外植体，放置于无菌培养皿中，再将准备好的农杆菌菌液倒入其中，完全浸没，侵染30min，其间摇动数次。（3）共培养：将叶片转移到无菌吸水纸上，吸干其表面多余的菌液，然后依次转移到事先已准备好的共培养基中，在25-26℃、暗培养2-3d。（4）选择培养：共培养结束后，将叶片外植体转移到选择培养基中，放置于25℃、光照培养，15d后再转一次培养基。（5）高浓度Kan筛选：经过选择培养大约20-25d后，不定芽形成，切下1.5cm64 新疆农业大学博士（硕士）学位论文以上不定芽转到高浓度Kan培养基中筛选，7d后嵌合体幼苗将逐步变黄死亡，存活的不定芽大多数为高抗Kan的纯合体。（6）壮苗培养：经过高浓度Kan筛选10d后存活的不定芽，将其转入壮苗培养基中，经过10-15d后，幼苗将生长到3cm以上。（7）生根培养：将3cm以上的幼苗从壮苗培养基中转移到生根培养基中，10d后不定芽生根。5.2.10转基因植株的筛选5.2.10.1DNA-PCR检测（1）烟草总DNA提取：将再生植株编号，采用SDS-CTAB法提取烟草总DNA，提取过程严格按照《分子克隆实验指南》第三版中介绍的步骤进行。（2）PCR反应体系及程序：与5.2.2.5PCR反应体系及程序相同。PCR扩增后经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。5.2.10.2RT-PCR检测（1）烟草总RNA提取：PCR检测呈阳性的再生植株编号后，利用北京天恩泽基因有限公司生产的植物总RNA提取试剂，提取烟草总RNA，提取过程按照该说明书进行略有改动。提取后1%琼脂糖凝胶电泳检测。（2）cDNA第一链的合成：1μg总RNA用于cDNA第一链的合成，利用Fermentas公司生产的反转录试剂盒合成cDNA第一链，合成步骤严格按RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit反转录试剂盒说明书进行，cDNA第一链合成后-20℃保存备用。（3）cDNA-PCR检测：所用引物、PCR反应体系和扩增程序同5.2.8.5，cDNA-PCR扩增后将所得的PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。5.2.11转基因烟草的接种对T1代转RGBCH、SGBCH基因和非转基因烟草种子每单株种于营养钵中，[136]每个材料分别种植30株，采用菌液浇根法，在每个营养钵中灌入30mL枯萎菌孢子悬浮液，以灌入等量清水的未转基因烟草做对照。5.3结果与分析65 海岛棉枯萎病抗性相关基因的克隆及功能验证5.3.1pCAMBIA1301-RGBCH、pCAMBIA1301-SGBCH植物表达载体的构建将目的片段从重组质粒pMD18-T/RGBCH、pMD18-T/SGBCH切下，并和同样XbaⅠ和BamHⅠ酶切的pCAMBIA1301空载体相连，转化大肠杆菌DH5α，经卡那霉素（Kan）筛选后，得到植物表达载体pCAMBIA1301-RGBCH、pCAMBIA1301-SGBCH质粒（见图5-2）。注：M：DL15000Marker；1：重组质粒pCAMBIA1301-RGBCH；2：重组质粒：pCAMBIA1301-SGBCHNote:M:DL15000Marker;1:recombinantpalsmidpCAMBIA1301-RGBCH;2:recombinantpalsmidpCAMBIA1301-SGBCH图5-2重组质粒pCAMBIA1301-RGBCH、pCAMBIA1301-SGBCH电泳结果Fig.5-2ElectrophoresisresultofrecombinantpalsmidpCAMBIA1301-RGBCH、pCAMBIA1301-SGBCH5.3.2pCAMBIA1301-RGBCH、pCAMBIA1301-SGBCH植物表达载体的酶切检测构建的植物表达载体pCAMBIA1301-RGBCH、pCAMBIA1301-SGBCH，用XbaⅠ与BamHⅠ进行单酶切和双酶切，如图5-3，双酶切的结果很明显看见一条约765bp片段，与我们预期的大小一致。说明目的基因pCAMBIA1301-RGBCH、pCAMBIA1301-SGBCH已经成功插入多克隆位点，构建成新植物表达载体pCAMBIA1301-RGBCH、pCAMBIA1301-SGBCH。注：M：DL15000Marker；1、2：pCAMBIA130-RGBCH、pCAMBIA1301-SGBCH质粒；3、4：XbaⅠ酶切质粒pCAMBIA1301-RGBCH、pCAMBIA1301-SGBCH；5、6：BamHⅠ酶切pCAMBIA1301-RGBCH、pCAMBIA1301-SGBCH质粒；7、8：XbaⅠ与BamHⅠ双酶切质粒pCAMBIA1301-RGBCH、pCAMBIA1301-SGBCHNote:M:DL15000Marker;1、2:recomminantplasmidpCAMBIA1301-RGBCH、pCAMBIA1301-SGBCH;3、4:pCAMBIA1301-RGBCH、pCAMBIA1301-SGBCHdigestedbyXbaⅠ;5、6:pCAMBIA1301-RGBCH、pCAMBIA1301-SGBCHdigestedbyBamHⅠ;7、8:pCAMBIA130-RGBCH、pCAMBIA1301-SGBCHdigestedbyXbaⅠandBamHⅠ图5-3重组质粒pCAMBIA1301-RGBCH、pCAMBIA1301-SGBCH酶切鉴定结果Fig.5-3EnzymedigestionresultofrecombinantplasmidpCAMBIA1301-RGBCH、pCAMBIA1301-SGBCH5.3.3根癌农杆菌中植物表达载体的PCR检测66 新疆农业大学博士（硕士）学位论文从转化植物表达载体的农杆菌中分别提取质粒pCAMBIA1301-RGBCH和pCAMBIA1301-SGBCH的DNA用于PCR检测，用抗性筛选报告基因（nptⅡ）引物和目的基因特异引物扩增到预期大小的片断（图5-4），说明植物表达载体已成功地转化根癌农杆菌EHA105菌株。注：M：DL2000Marker；1、2：抗性筛选报告基因nptⅡPCR产物；3、4：转化农杆菌pCAMBIA1301-RGBCH、pCAMBIA1301-SGBCH质粒PCR产物Note:M:DL2000Marker,1、2:ThePCRproductofResistancescreeningreportergenenptⅡ;3、4:transformedagrobacterium图5-4农杆菌pCAMBIA1301-RGBCH、pCAMBIA1301-SGBCH转化子的PCR鉴定Fig.5-4IdentificationoftransformantsbyPCRamplification5.3.4转基因烟草的获得以根癌农杆菌EHA105侵染经过预培养3d的烟草叶盘，暗光共培养3d后，再经过选择培养20-25d抗性芽形成（图5-5）。图5-5抗性芽形成+Fig.5-5Kanbudsoftobaccodiffferentiation将1.5cm以上的抗性再生植株切下转移到高浓度Kan筛选培养基中，7-10d后将得到高抗Kan再生植株（图5-6），从图5-6可以看出，高抗Kan再生植株可以在高浓度Kan筛选培养基中健康生长，同时嵌合体黄化并停止生长。67 海岛棉枯萎病抗性相关基因的克隆及功能验证图5-6高浓度Kan筛选培养Fig.5-6BigconcentrationKantocultivate将高抗Kan再生植株转移到壮苗培养基中，再培养10-15d将得到3cm以上的壮苗（图5-7）。图5-7壮苗培养Fig.5-7Strongseedling壮苗培养10d后，将其转移到生根培养基中再培养10d以上，再生植株即可生根（5-8）。取下部分叶片进行鉴定，待根系成熟后，将鉴定呈阳性的植株移出培养瓶，炼苗2-3d之后，移栽到温室培养，直到烟草成熟开花。图5-8生根培养Fig.5-8Rootculture5.3.5转基因烟草的鉴定5.3.5.1DNA-PCR检测转基因烟草68 新疆农业大学博士（硕士）学位论文分别对转有RGBCH、SGBCH基因的进行DNA-PCR检测，分别随机抽取7株转化植株，阴性对照植株的DNA-PCR扩增产物和H2O的PCR扩增产物作为DNA-PCR检测的阴性对照。经过电泳分析，转有RGBCH基因的共有4棵扩增出765bp大小的明亮清晰的特异性条带（图5-9），转有SGBCH基因的共有4棵扩增出765bp大小的明亮清晰的特异性条带（图5-10），初步表明外源基因已经整合进烟草植株的基因组中。注：M：DNA标准分子量1000bp，1-7：转基因植株PCR产物A：阳性对照PCR产物；B：H2O的PCR产物Note:M：DNAMarker1000bp，1-12：productsoftransgenicplantDNA-PCRA:productsofmasculinecontrolplantDNA-PCR;B:productsofH2O图5-9DNA-PCR检测转RGBCH基因烟草Fig.5-9TheDNA-PCRanalysisoftransgenicRGBCHtobacco注：M：DNA标准分子量2000bp；1-7：转基因植株PCR产物A：阳性对照PCR产物；B：H2O的PCR产物Note:M：DNAMarker2000bp；1-12：productsoftransgenicplantDNA-PCRA:productsofmasculinecontrolplantDNA-PCR;B:productsofH2O图5-10DNA-PCR检测转SGBCH基因烟草Fig.5-10TheDNA-PCRanalysisoftransgenicSGBCHtobacco5.3.5.2RT-PCR检测转基因烟草分别对DNA-PCR检测呈阳性的转基因植株，提取其RNA（图5-11）并反转录合成第一链cDNA后，进行RT-PCR检测，从图4-12中可以看出，均扩增出明亮清晰的特异性条带，表明外源基因已经整合进烟草植株的基因组中并转录产生了69 海岛棉枯萎病抗性相关基因的克隆及功能验证mRNA。注：M：DNA标准分子量2000bp；1-4：转RGBCH基因植株；5-8：转SGBCH基因植株Note:M:DNAMarker2000bp;1-4:transgenicRGBCHgene;5-8transgenicgene图5-11转基因植株RNA的提取Fig.5-11TotalRNAextractedoftransgenicgene注：M：DNA标准分子量2000bp；1-4：转RGBCH基因植株RT-PCR产物；5-8：转SGBCH基因植株RT-PCR产物Note:M:DNAMarker2000bp;1-4:productsoftransgenicRGBCHplantRT-PCR;5-8:productsoftransgenicSGBCHplantRT-PCR图5-12RT-PCR检测Fig.5-12TheRT-PCRanalysisoftransgenictobacco5.3.5.3烟草转基因植株的抗病性鉴定为了进一步分析RGBCH和SGBCH基因在枯萎病病菌诱导的作用与功能，我们比较了转基因烟草植株和非转基因烟草植株对枯萎病病原菌的抗感性，每种材料分别种植30株。实验结果表型如图5-13、图5-14和图5-15。转RGBCH基因的植株的存活率为78%，而转SGBCH基因植株的存活率为24%，大多数的植株叶片干枯死亡，非转基因植株几乎全部死亡。这些结果表明了RGBCH基因的转入提高了烟草的抗枯萎病病菌的能力。70 新疆农业大学博士（硕士）学位论文a诱导前b清水对照c诱导后图5-13非转基因烟草抗性鉴定Fig.5-13ResistanceIdentificationofnon-transgenictobaccoa诱导前b清水对照c诱导后图5-14转RGBCH基因烟草抗性鉴定Fig.5-14ResistanceIdentificationoftransgenicRGBCHgenetobacco图5-15转SGBCH基因烟草抗病性鉴定Fig.5-15ResistanceIdentificationoftransgenicRGBCHgenetobacco5.4讨论本实验通过构建植物表达载体，利用农杆菌介导的叶盘法，将与抗病相关的基因RGBCH和SGBCH成功转入烟草，获得卡那霉素抗性的转基因烟草植株。经DNA水平上的PCR检测和RNA水品上的RT-PCR检测，证明外源基因RGBCH71 海岛棉枯萎病抗性相关基因的克隆及功能验证和SGBCH已整合到烟草基因组中。成功的构建了根癌农杆菌介导的高效植物表达的载体pCAMBIA1301-RGBCH、pCAMBIA1301-SGBCH。本研究经过一系列筛选获得转RGBCH基因烟草15株和转SGBCH基因烟草12株，并收获T1代大量种子，为后续对转基因烟草抗病性分析打下了基础。利用病原菌的毒素对其寄主诱导后进行防卫反应相关的差异表达研究已经有大量文献报道，而针对病原菌的抗病性研究采用的方法则主要是用孢子悬浮液对植株的根部进行接种，这种方法体现了自然条件下病原菌的致病能力，在寄主与病原菌能发生显著亲和反应的情况下，该方法是最为有效的。病原菌侵染寄主后产生的毒素目前大多数的观点认为是一种蛋白-脂多糖复合物，目前还很少有研究报道该复合物对于枯萎病菌本身的生理和生殖是否具有作用，它与胞外水解酶一样同属于细胞外分泌物，尽管它能够引发寄主体内多种抗病防卫反应，但目[137]前看来它的主要功能还是在于使寄主细胞发生功能紊乱，同时也很难设想合成过程如此复杂的糖蛋白复合物最终的作用不是使寄主植物致病。基于这种考虑，本研究采用枯萎菌的毒素来验证转基因烟草的抗病性，可以比较明确的显示出转基因植株对毒素的抗性是否得到了提高。结果显示转RGBCH基因的植株的大部分叶片呈黄化状态，并有少数叶片枯死；而转SGBCH基因植株的叶片大部分呈现凋零状态；非转基因植株几乎全部死亡。可以看出转RGBCH基因植株生长受抑制的程度低于转SGBCH基因植株和非转基因植株，但一样也出现了叶片萎蔫、褪绿等枯萎病症状。转RGBCH基因植株的病株率和病情指数低于转SGBCH基因植株，表明RGBCH能够在一定程度上提高转基因植株对枯萎病的耐受性。从RGBCH参与调控的下游防卫基因的功能为出发点来分析，推测RGBCH的作用可能在于提高某些抗真菌蛋白的表达水平，从而抑制真菌的生长。我们认为可能枯萎病菌毒素并非那些受RGBCH调控的抗真菌蛋白的作用靶标，因此RGBCH转基因烟草纯合株系在毒素处理后的症状与对照相比差别不是非常明显。由于以毒素处理不能完全模拟自然条件下枯萎病菌侵染寄主的过程，因此利用孢子悬浮液接种进行抗性鉴定是必要的。这些结果表明了RGBCH基因的转入提高了烟草的抗枯萎病病菌的能力。72 新疆农业大学博士（硕士）学位论文第六章结论与展望6.1RGA标记的开发与应用根据GenBank数据库上公布的抗病基因序列，设计出107对RGA引物，利用高抗枯萎病的海岛棉品种“06-146”、高感枯萎病的海岛棉品种新海14号及以杂交F2群体中随机选取的180个单株为材料，利用RGA引物在亲本间筛选出来的12对引物在抗、感基因池中进行筛选，初步确定Gbrga14a是与海岛棉枯萎病紧密连锁的分子标记，该分子标记与海岛棉枯萎病抗性的交换值分别为15.5%，与海岛棉抗枯萎病基因的遗传距离分别为15.92cM。查找连锁标记的来源发现，根据拟南芥RPP5基因设计的引物最多，有4对（占33.33%）。这12对具有多态性的RGA标记主要由3类组成，其中TIR-NBS-LRR类6对，占50%；NBS-LRR类5对，占41.67%；NBS类1对，占8.33%。6.2RGBCH、SGBCH基因的克隆通过对Gbrga14在两亲本间扩增出来的位点进行回收测序，以该测序片段为探针，通过电子克隆的方法，分别克隆到两条抗性相关基因，命名为RGBCH和SGBCH。经BLAST分析发现两个片段与已知的植物逆转录基因有着很高的相似性。序列上的差异性导致它们之间的不同功能。ProtFun预测RGBCH蛋白的主要功能是参与能量代谢和生物合成辅助因子；SGBCH蛋白的主要功能是参与蛋白质翻译过程中的能量转换。6.3抗性相关基因在海岛棉和陆地棉中的表达分析本研究采用棉花苗期孢子悬浮液浸根接种法，利用SYBRGreenI实时荧光定量PCR方法，观察棉花抗枯萎病相关基因在不同棉花品种、不同组织器官（叶片、下胚轴、根）中随时间的表达量变化差异情况。利用该方法检测分析得出，利用特异性引物GBCH-Q材料的荧光定量PCR分析可知：品系“06-146”目的基因的不同组织的表达量在4d达到一个峰值，在叶片中10d产生第二个峰值；新海14号的目的基因在6d时出现一个最高值，随后降低到最初水平；中棉所73 海岛棉枯萎病抗性相关基因的克隆及功能验证35号、军棉1号和TM-1在诱导前和诱导后表达量均很微弱或者比较一致，基本维持在低水平表达，通过利用引物StVe-Q对材料的荧光定量PCR分析可知：品系“06-146”、新海14号、中棉所35号、军棉1号和TM-1的目的基因在病菌诱导条件下，没有随着诱导时间的变化而呈现表达变化状态。由此可以看出本实验克隆出来的RGBCH和SGBCH基因在海岛棉防御病原菌的侵入时起到相应的作用，有关作用原理还需要进一步分析。6.4RGBCH、SGBCH基因植物表达载体的构建将RGBCH、SGBCH基因重组到pCAMBIA1301植物表达载体上，构建了海岛棉pCAMBIA1301-RGBCH、pCAMBIA1301-SGBCH的表达载体，同时利用农杆菌介导的方法，将RGBCH、SGBCH基因成功整合到烟草基因组中，并获得T1代种子。对于转基因烟草T1代采用菌液浇根法（每种材料种植30株），在每个营养钵中灌入适量孢子悬浮液，以灌入等量清水的棉苗做对照。结果显示转RGBCH基因的大部分植株叶片呈黄化状态；而转SGBCH基因的大多数植株叶片干枯死亡，非转基因植株几乎全部死亡。这些结果表明了RGBCH基因的转入提高了烟草的抗枯萎病病菌的能力。6.5展望海岛棉枯萎病抗性相关基因RGBCH和SGBCH已经克隆，对其推测的蛋白已经利用生物信息学的方法进行了预测，但是抗病相关基因的表达产物还没有分离出来。下一步的工作重点主要是分离抗病相关基因的蛋白，并且着重研究抗病相关基因的蛋白和枯萎病菌之间的相互作用，揭示抗病机理，丰富抗病的理论体系。根据本研究的结果，须结合实际生产，重视抗病育种的选种问题，有利于在育种实践中选育抗病品种，从而推动新疆海岛棉新品种的培育工作。74 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新疆农业大学博士（硕士）学位论文致谢本论文是在恩师曲延英教授的悉心指导下完成的，在此谨向尊敬的恩师致以衷心的感谢！感谢她四年来在生活上无微不至的关怀以及在学习上严格的要求和谆谆的教诲；特别在论文的设计、实施和撰写方面进行了具体的指导、斟字酌句的修改指正。恩师高尚正直的品格、执着的敬业精神、严谨的治学态度和渊博的知识使我永生不忘。感谢陈全家教授和高文伟副教授！感谢他们在试验的实施方面给予的指导，在平时学习和生活上给予的帮助，感谢他们四年来对我的关心和照顾。感谢王莉萍老师、于月华老师及耿洪伟老师在平时学习中给予的帮助；感谢苏秀娟老师在实验室的仪器、工具的使用方法和实验过程中给予的帮助。感谢农业生物技术重点实验室的郭忠军、马顺尧、陈磊、柴颜军、郑炜佳、王海标、杨婷、李琼、许春华、姚元、管长娟、孟灵真、梁维维、阿依夏木姑丽等师弟师妹们在实验时、生活中给予的帮助特别感谢多年来理解、关爱和支持我的父母，感谢他们对我的养育之恩。在攻读博士学位的四年里，远离操劳的父母，学业论文完成之时，更多的是对父母歉疚，同时更增加了对他们的感激，在每一个进步的背后，都凝聚着他们付出的汗水和牺牲。借此机会，谨向所有教育、指导、关心、鼓励和帮助过我的老师、同学、朋友和亲人们表示最衷心的感谢！刘艳2013年6月83 海岛棉枯萎病抗性相关基因的克隆及功能验证作者简介一主要经历：刘艳，女，1982年12月出生，吉林省吉林市人，中共党员。2006年9月大学毕业于廊坊师范学院数学与应用数学专业，2009年毕业研究生于新疆农业大学农学院作物遗传育种专业，2009年9月考取新疆农业大学农学院作物遗传育种专业博士研究生，师从曲延英教授，在新疆农业大学农学院生物技术重点实验室做实验，并完成博士学位论文。二在学期间参加的研究项目：1、自治区高技术研究发展计划项目—“棉花抗病分子机制研究及抗病分子品种创制”(项目编号：20080101）2、自治区教育厅重点项目（项目编号：XJEDU2007I15）3、国家863项目—“分子聚合多抗高产优质新品种培育”（2012AA101108-05）4、国家自然科学基金项目—“海岛棉高密度遗传连锁图谱构建及抗病标记辅助选择效应评价”（项目编号：31260361）三在读期间发表的论文：1、刘艳,陈全家,曲延英等.利用SRAP-BSA法筛选棉花抗病基因的分子标记[J].新疆农业科学,2009,46(6):1158-1163.2、刘艳,曲延英等.RGA标记的开发及应用[J].新疆农业大学学报.2013年第4期.(录用函)3、刘艳,曲延英等.海岛棉枯萎病抗性相关基因RGBCH的克隆、原核表达及抑菌活性分析[J].新疆农业大学学报.2013年第5期.(录用函)4、冯方剑,陈全家,姚正培,李杨阳,刘艳,曲延英.棉花苗期抗旱相关指标的主成分分析及综合评价[J].新疆农业大学学报,5、李杨阳,曲延英,杨婷,刘艳,陈全家.以GFP为报告基因优化农杆菌介导海岛棉转基因体系的研究[J].新疆农业大学报,6、杨婷,曲延英,李琼,刘艳,孟灵真,陈全家.影响农杆菌介导海岛棉胚性愈伤组织遗传转化因素的分析[J].新疆农业大学学报,84 新疆农业大学博士（硕士）学位论文7、陈磊,李吉琴,刘艳,陈全家,顾爱星,马顺尧,柴颜军,郑炜佳,曲延英.海岛棉枯萎病对产量因素以及相关指标的遗传分析[J].新疆农业大学学报,2012,35(3):1-5.8、柴颜军,陈全家,曾凯,陈磊,刘艳,王海标,谢元元,郑炜佳,曲延英.海岛棉产量、产量性状及品质性状的相关研究[J].新疆农业科学,2013,12.85 新疆农业大学博士（硕士）学位论文
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