棉花ghsamdc234基因的克隆及功能研究

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1、分类号：密级：学号：2012107013单位代码：10759石河子大学硕士学位论文棉花GhSAMDC2/3/4基因的克隆及功能研究学位申请人王凡龙孙杰教授指导教师朱华国副教授申请学位门类级别农学硕士学科、专业名称作物遗传育种研究方向作物分子育种所在学院农学院中国·新疆·石河子2015年6月CloningandfunctionanalysisofGhSAMDC2/3/4geneincotton(GossypiumhirsutumL)ADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillme

2、ntoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofAgricultureByWangFan-long(CropGeneticBreeding)DissertationSupervisor:Prof.SunJieA.Prof.ZhuHua-guoJune,2015石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明摘要棉花是全世界重要的经济作物，也是盐碱地种植的先锋作物之一。在棉花生产中，陆地棉种植最为广泛，占全世界棉花总产量的90%以上。新疆作为我国的植棉大省，连续20年保持单产、总产和调出量的全国第一，棉花种植业已经成为新

3、疆经济的重要支柱和棉区农民收入的主要来源。但由于全球气候变暖、水资源利用不合理及灌溉不良引起土壤盐渍化等逆境严重影响棉花正常的生长发育，也使棉粮争地的矛盾日益突出。大量研究表明，植物对非生物逆境的响应依赖于逆境感知、信号转导、逆境应答相关基因和代谢途径等一系列分子网络的激活表达。而传统棉花育种目标多关注产量形成因子、纤维品质特性、抗枯（黄）萎病及抗虫性，很少研究棉花对干旱、盐碱、重金属、极端温度等逆境的抗性遗传及育种利用。诸多研究表明，植物体内多胺含量的增加能显著性提高其抗逆性。SAMDC是多胺合成中的三个关键酶之一，在植物抗逆境中发挥重要作用。

4、目前SAMDC基因已在多种植物中克隆，并对其基因功能进行了一定研究。本研究从陆地棉中克隆到SAMDC同源基因，利用QRT-PCR技术分析该同源基因在不同逆境条件下的表达特性，进而选择逆境条件下特异表达基因转化模式植物拟南芥和陆地棉，并进行了相关生理研究，以期通过调控SAMDC基因表达改变棉花中多胺表达水平，为植物抗逆育种提供新途径。1.在已知GhSAMDC1基因的基础上，利用电子克隆结合RT-PCR技术克隆获得陆地棉（GossypiumhirsutumL）S-腺苷蛋氨酸脱羧酶（S-adenosylmethioninedecarboxylase,S

5、AMDC）基因家族三个同源基因，分别命名为GhSAMDC2、GhSAMDC3和GhSAMDC4。序列分析显示，该基因mORF分别为1068bp、1110bp和1032bp，编码355、369和343个氨基酸。聚类分析表明，GhSAMDC2与GhSAMDC3蛋白亲缘关系最近；GhSAMDC4与拟南芥AtSAMDC4聚为一类。实时荧光定量PCR分析表明，GhSAMDC2在茎中表达相对较高，并随着纤维发育表达量不断增加，在纤维发育后期表达量达到最高；GhSAMDC2/3/4在不同的胁迫条件下表现出不同的表达模式，GhSAMDC2受低温和干旱胁迫诱导最强

6、烈，GhSAMDC3响应盐胁迫显著，GhSAMDC4受ABA诱导强烈。2.将构建的pGWB17-GhSAMDC2/3/4超表达载体转化模式植物拟南芥，Kana筛选获得纯合体并进行PCR及QRT-PCR验证，均获得了转基因阳性植株。选择基因表达量高的株系进行NaCl胁迫处理。结果表明，200mMNaCl处理下，生长第三天时转GhSAMDC3基因拟南芥种子萌发率显著高于野生型，为野生型的10.89倍；第七天时转GhSAMDC3基因拟南芥种子萌发率是WT的1.34倍，表明GhSAMDC3基因显著提高了盐胁迫下拟南芥的种子萌发。用300mMNaCl处理野

7、生型和转GhSAMDC3基因拟南芥幼苗，GhSAMDC3基因在48h表达量显著升高；利用高压液相色谱分析300mMNaCl处理下野生型及转基因拟南芥PAs含量，发现转基因拟南芥中亚精胺含量极显著升高，并且（Spd+Spm）/Put值显著高于野生型，也说明了转基因拟南芥中多胺代谢比I野生型中更加活跃。3.分别构建了pGWB17-GhSAMDC2/3/4植物超表达载体，通过农杆菌侵染棉花下胚轴的方法转化棉花品种YZ-1号和新陆早33号，继代培养得到抗性植株。提取抗性棉花的基因组DNA进行PCR验证，除pGWB17-GhSAMDC4未获得胚性愈伤外，其

8、余均得到阳性转基因棉花植株。另外转pGWB17-GhSAMDC3胚性愈伤生长量显著高于对照。关键词：棉花，拟南芥，多胺，GhSAMDC2