奶牛乳腺炎相关mirna表达研究及mir-146a靶基因的初步鉴定

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1、分类号：S813.3学校代码：10712UDC：636研究生学号：2011060152密级：公开级2015届攻读博士学位研究生学位（毕业）论文奶牛乳腺炎相关miRNA表达研究及miR-146a靶基因的初步鉴定学科专业：动物遗传育种与繁殖研究方向：动物育种原理与方法研究生李志雄指导教师：刘小林教授完成时间：2015年5月中国陕西杨凌Classificationcode:S813.3Universitycode:10712UDC:636Postgraduatenumber:2011060152Confidentialitylevel:Unclassifie

2、dDissertationforDoctorDegreeNorthwestA＆FUniversityin2015IDENTIFICATIONANDCHARACTERIZATIONOFMASTITIS-RELATEDMIRNASINPERIPHERALBLOODFROMHEALTHYANDMASTITISBOVINEANDTARGETGENEANALYSISOFMIR-146AMajor:AnimalGenetics,BreedingandReproductionResearchfield:AnimalBreedingPrincipleandMethod

3、NameofPostgraduate:ZhixiongLiAdviser:Prof.XiaolinLiuDateofsubmission:May,2015YanglingShaanxiChina本研究由国家科技计划重大项目“863”课题：牛分子细胞工程育种技术创新与优势性状新品系培育（2008AA101010）陕西省“13115”科技创新工程项目：牛羊生物技术育种共性关键技术研究与试应用（2008ZDKG-11）西安市科技计划项目：奶牛分子育种关键技术研究与应用（NC09049-2）资助完成奶牛乳腺炎相关miRNA表达研究及miR-146a靶基因的初步

4、鉴定摘要奶牛乳腺炎是乳腺组织受到外界刺激而引起的一系列炎症反应，是奶牛养殖业中发病率最高，经济损失最严重的一种疾病。miRNA能够参与基因调控表达，已被证实参与新陈代谢、激素的分泌、免疫应答、疾病的发生等各种生物学过程。奶牛机体内乳腺炎相关基因的表达与miRNA的转录调控密切相关。因此，本研究通过构建奶牛外周血小RNA文库，采用高通量测序技术和生物信息学分析获得健康和患乳腺炎荷斯坦奶牛中保守和新发现的miRNA序列，并进一步分析其序列特征；筛选出健康和患乳腺炎荷斯坦奶牛中差异表达的miRNA序列并利用定量PCR技术对其进行验证；利用基因克隆、PCR-R

5、FLP等技术对差异表达miRNA序列的靶基因PRMT2的遗传变异进行了研究；最后还通过构建载体、细胞转染等技术对miR-146a的靶基因进行了验证，本研究的主要研究结果如下：1.荷斯坦奶牛外周血中miRNA序列的高通量测序采集健康和患乳腺炎荷斯坦奶牛外周血构建小RNA文库，利用Solexa高通量测序技术分别得到原始序列16,733,120条和9,373,740条，去除低质量数据后，分别获得可用序列10,654,985条8,708,111条，各占原始总数据的63.68%和93.90%。对两个文库的miRNA序列长度进行分析，发现两个文库中miRNA序列主

6、要集中在21~23nt，健康荷斯坦奶牛中长度为21~23nt的miRNAs序列占全部miRNAs序列的83.42%，其中长度为23nt的miRNAs序列最多，占到29.82%；患乳腺炎荷斯坦奶牛中长度为21~23nt的miRNAs序列占全部miRNAs序列的85.36%，其中长度为21nt的miRNAs序列最多，占到32.53%。2.荷斯坦奶牛外周血miRNA的鉴定和特征分析将获得的可用序列进行整理、归类分析，所有纯净序列经过比对之后，在两个文库中共检测到608条pre-miRNA编码753条成熟的miRNA，其中448条为已知miRNA；25条为保守

7、miRNA；270条为新发现miRNA。将检测到的608条pre-miRNA在牛染色体上进行定位，共有516条pre-miRNA可以定位到牛染色体，各染色体上pre-miRNA的分布密度在0.08~0.58条/Mbp之间，同时还发现：有些miRNA序列位于同一pre-miRNA的两端，但它们的测序读数不同，甚至有些序列有很大的差异，具有这样特点的miRNA序列共有145对。基因簇分析表明：当MID=3Kb时，134个pre-miRNA形成56个簇；当MID=10Kb时，150个pre-miRNA形成59个簇；当MID=50Kb时，157个pre-miR

8、NA形成58个簇。3.荷斯坦奶牛外周血miRNA的验证为了进一步验证本研究中高通量测序结果的准