虫草素代谢相关基因5'-nucleotidase部分序列的克隆、表达及相关研究

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1、分类号：Q93单位代码：10193密级：公开学号：2012087硕士学位论文虫草素代谢相关基因5'-nucleotidase部分序列的克隆、表达及相关研究Cloningandexpressionof5'-nucleotidasepartialsequenceofcordycepinmetabolismrelatedgeneandrelatedresearch作者姓名：郝芳芳学位类别：理学硕士专业名称：微生物学研究方向：微生物功能基因组学指导教师：卢天成讲师所在学院：生命科学学院2015年5月独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下，独

2、立进行研究所取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢所列内容外，论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本学位论文所有内容若有不实之处，本人愿意承担一切相关法律责任和后果。学位论文作者签名：签字日期：年月日关于学位论文使用授权的声明1、本人完全了解吉林农业大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间所完成的论文及相关成果的知识产权属吉林农业大学所有，并同意将本论文的版权授

3、权给吉林农业大学，学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。2、本人（同意/不同意，务必打印后填写）吉林农业大学将本论文版权授权给不同媒体进行电子出版、多媒体出版、网络出版以及其他形式出版（涉密学位论文解密后应遵守此协议）。3、本人声明毕业后若发表在攻读研究生学位期间完成的论文及相关的学术成果，必须以吉林农业大学作为第一署名单位。学位论文作者签名：签字日期：年月日指导教师签名：签字日期：年月日摘要虫草素(Cordycepin)即3'-脱氧腺苷，它是一种核苷类抗菌素，是蛹虫草（Cord

4、ycepsmilitaris）重要的药用活性成分之一，具有抑菌、抗肿瘤、抗衰老以及增强免疫力等作用。但目前对虫草素的生物合成途径尚不明确，还需要进一步研究证实。本研究首先对蛹虫草进行液体深层发酵培养，利用高效液相色谱（HPLC）法检测发酵液中虫草素的含量变化，绘制虫草素产生曲线。根据已知虫草素合成途径假说选定相关基因，以肌动蛋白基因actin和18SrRNA为内参，采用实时荧光定量PCR对相关基因进行定量分析。根据目的基因检测的相对值表明5'-nucleotidase和腺苷酸激酶基因在菌丝体中上调表达趋势与虫草素产生曲线一致，根据虫草素产生曲线、已知的

5、虫草素合成途径假说、实时荧光定量PCR初步确定虫草素是按AMP→ADP→dADP→dAMP→虫草素的脱氧腺苷途径合成的，5'-nucleotidase为虫草素合成相关的重要基因。利用3'RACE试剂盒扩增5'-nucleotidase基因的3'端序列，序列大小为1270bp，并构建了3'末端的原核表达质粒，将其转入大肠杆菌BL21中诱导表达，获得了大量表达蛋白。经鉴定为包涵体蛋白，将包涵体蛋白经洗涤、溶解，再利用梯度透析的方法进行复性，并经过HisTrapTMFF亲和层析柱进行纯化，获得了较高纯度的重组蛋白，该蛋白的相对分子质量为42kDa。经过生物信

6、息学分析，其结构包含13个α螺旋和26个β折叠。将纯化的蛋白用弗氏完全佐剂和不完全佐剂进行乳化，免疫兔子，制备了多克隆抗体。以阳性血清为一抗，以辣根过氧化物（HRP）标记山羊抗兔IgG为二抗，对重组蛋白进行Western免疫印迹检测，结果表明重组蛋白可以被阳性血清特异性识别。在42kDa处出现特异性条带。利用三氯乙酸-丙酮沉淀法提取蛹虫草菌丝体的全蛋白，以阳性血清作为一抗作用于全蛋白，Westernblot检测，结果显示阳性血清可以与全蛋白反应，目的条带在135-180kDa处，但需要进一步鉴定。综上所述，本实验通过相关研究，筛选到虫草素合成相关的基因

7、，为研究虫草素代谢途径奠定了基础，同时对相关基因进行表达，为进一步研究代谢途径中酶的作用及其调控机制提供实验基础。关键词：蛹虫草，虫草素，5'-nucleotidase，原核表达，纯化IAbstractCordycepin(3'-deoxyadenosine)isakindofnucleosideanalogue,oneoftheimportantcompoundsinCordycepsmilitaris.Ithasmanypharmacologicalfunctionsuchasantitumor,anti-tumor,anti-aging,enha

8、ncingimmuneandsoon.Butforcordycepinbiosynthetic