没食子酸修饰金、银纳米颗粒的细胞毒性研究

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1、中文摘要没食子酸修饰金、银纳米颗粒的细胞毒性研究没食子酸（gallicacid,GA）或3,4,5-三羟基苯甲酸，是一种天然的多酚类化合物，作为自由分子或单宁酸分子的一部分，广泛存在于水果和植物中，具有天然的抗氧化、抗过敏、抗诱变、抗癌、抗病毒、抗菌和抗炎等生物活性。经研究证实，GA可诱导多种肿瘤细胞凋亡，在预防癌症转移和恶化中起到非常重要的作用。纳米材料是指那些在三维空间中有一维或多维处于纳米尺度（1-100nm）范围内的材料。其本身及由它们作为基本单元构成的新材料，由于小尺寸和大比表面积等效应而有独特的光学、电子或机械性能。具有卓越物理和化学性质的纳米材料正日益渗入到生物和医学研究领域，

2、为现代生物学成像，医学诊断和治疗提供了更加灵敏和可靠的材料和方法。金、银等贵金属纳米颗粒或者以其为结构单元所构成的纳米材料在光学、催化、生物工程和医学等研究领域占有非常重要的地位。GA作为还原剂和稳定剂合成的金纳米颗粒（goldnanoparticles,AuNPs）曾被用于生物分析，但此种金纳米颗粒对人类细胞系毒性还没有被研究过。我们首先以GA同时作为还原剂和稳定剂，用简单、“绿色”的一步法合成了GA修饰的金纳米颗粒（GA-AuNPs），并对其吸收光谱和尺寸等进行了表征。通过比较合成反应前后的溶液中GA的紫外吸收来确定结合于GA-AuNPs上GA的摩尔数。通过与等摩尔数的自由GA生物活性比

3、较，确定了含有终浓度为0.065，0.13，0.26，0.52和0.65mM结合GA的GA-AuNPs对人类肝细胞（humanhepatocytecell,HL-7702）的生长和凋亡的影响。实验结果表明：含有相同摩尔数结合GA的GA-AuNPs的细胞毒性和细胞凋亡的诱导能力与自由GA相比均有很大程度的下降。GA-AuNPs合成反应过程中，GA所发生的主要化学变化I是其分子结构中的两个酚羟基被氧化成其相应的醌形式。我们推断GA分子的毒性与它的酚羟基有很大关系，即GA酚羟基是决定其生物活性的主要基团。这与前人的用其它方法所取得的结论一致。因此，本研究在验证了GA-AuNPs细胞毒性和对细胞凋亡

4、影响情况的同时，也发现了一个简单的新方法来证明GA的酚羟基对生物活性具有决定性作用。微生物对抗生素的耐药性为抗微生物感染新药的开发带来了巨大挑战。银纳米颗粒（silvernanoparticles,AgNPs）因其广谱的抗菌活性和使用后不会产生新的耐药菌株等特性，已逐步成为非常有吸引力的抗生素替代产品。我们以一个简单、“绿色”的方法合成了GA修饰的银纳米颗粒（GA-AgNPs），其中GA同时作为GA-AgNPs的还原剂和稳定剂。银纳米颗粒形态、尺寸、zeta电势和吸收光谱分别用透射电子显微镜，动态光散射和紫外可见光谱进行了表征。我们用微量稀释等方法分别测得GA-AgNPs对三种微生物：大肠杆

5、菌（Escherichiacoli,E.coli）、金黄葡萄球菌（Staphylococcusaureus,S.aureus）和白色念珠菌（Candidaalbicans,C.albicans）的最小抑菌浓度（MinimalInhibitoryConcentration,MICs）分别为6、30和24µg/mL。然后，我们用MTT法和Calcein-AM/PI染色法分别考察了当终浓度为6，12，18，24和30µg/mL时，GA-AgNPs对正常肝细胞（HL-7702）和宫颈癌细胞（humancervicalcarcinoma,HeLa）的毒性。研究结果表明GA-AgNPs在浓度大于24µg

6、/mL时，其对HeLa细胞的毒性明显高于对照组（P<0.05）；而当其终浓度为30µg/mL时，GA-AgNPs对HL-7702细胞的毒性与对照组相比没有明显差异。接着我们采用Annexin-V/PI结合和Hoechst33342的核染色分析两种分析方法，分别比较了GA-AgNPs对HeLa和HL-7702细胞凋亡的影响。实验结果显示，经过上述浓度的GA-AgNPs处理后，HeLa细胞组的无论是早期还是晚期凋亡细胞的比例均高于HL-7702细胞组，而且相对活细胞比例分析的结果与毒性分析的结果一致。最后，我们对GA-AgNPs的细胞毒性和细胞凋亡的机理进行研究，我们分别测试了两种细胞经过GA-

7、AgNPs处理后的线粒体膜电位（mitochondrialmembranepotential,MMP）变化和细胞内活性氧（reactiveoxygenspecies,ROS）的产生情况。实验结果证明，GA-AgNPs引起了细胞内MMP降低和ROS的产II生，特别是在HeLa细胞中，这两种变化较为明显。综上所述，GA-AgNPs主要是通过降低细胞内MMP和引起细胞内ROS的产生来诱导HeLa细胞的凋亡以及坏死。