cry1i蛋白杀虫活性及作用机制的研究

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1、Cry1I蛋白杀虫活性及作用机制的研究TheExplorationofInsecticidalActivityandTheModelofActionofCry1IToxin作者姓名：赵灿专业名称：植物学研究方向：植物病原真菌分子生物学与抗病基因工程指导教师：潘洪玉教授学位类别：理学博士培养单位：植物科学学院论文答辩日期：2015年6月1日授予学位日期：年月日论文评阅人：答辩委员会组成：姓名职称工作单位姓名职称工作单位刘宝教授东北师范大学主席任炳忠教授东北师范大学高洁教授吉林农业大学委员李启云研究员吉林省农业科学院原亚萍教

2、授吉林大学高洁教授吉林农业大学王振平教授东北农业大学王庆钰教授吉林大学江元清教授西北农林科技大学原亚萍教授吉林大学秦庆明教授吉林大学王志春研究员中国科学院东北地理与农业生态研究所中文摘要Cry1I蛋白杀虫活性及作用机制的研究多基因策略被证明能有效地延缓害虫对转基因植物产生抗性，该策略是指将能够识别不同结合位点的蛋白共同用于转基因植物中。2014年全球转Bt基因玉米的种植面积达到5.5千万公顷，占据全球玉米种植总面积的30%，其中对玉米螟有效的基因主要是cry1Ab、cry1Fa。如此大面积种植含有这些基因的转基因玉米，也

3、大大提高了玉米螟对这些基因产生抗性的可能性。因此鉴定和发掘与Cry1A、Cry1Fa蛋白无交互抗性的新型cry基因，进而研究解释其杀虫机制，对于研发新一代转基因抗虫玉米具有重要的理论意义和应用价值。cry1Ie基因是本实验室分离克隆的、具有自主知识产权的杀虫基因，由于其编码的Cry1Ie蛋白对玉米螟具有高的杀虫活性，且Cry1I蛋白与目前商业化应用的Cry1A类蛋白无交互抗性，目前已经被用于转基因玉米的研究中。本研究旨在探索不同Cry1I蛋白的杀虫活性及Cry1I蛋白的作用机制，为Cry1Ie基因的推广及应用提供理论依据

4、和候选基因。本研究将新型的Cry1Ie2蛋白用胰蛋白酶进行消化，获得55kDa的核心片段。并通过亲和层析和离子交换对Cry1Ie2蛋白进行纯化，最终获得纯度较高的蛋白。纯化后的Cry1Ie2原毒素对7种鳞翅目害虫和1种鞘翅目害虫的杀虫活性测定结果显示：Cry1Ie2对亚洲玉米螟（Ostriniafurnacalis，Guenée）和欧洲玉米螟（Ostrinianubilalis，Hubner）具有高的活性，LC50分别为0.51μg/mL和18.49μg/mL。而甜菜夜蛾（Spodopteraexigua，Hiibner

5、），美洲棉铃虫（Helicoverpazea，Boddie）和黄粉虫（Tenebriomolitor，Linnaeus）的生物活性测试中均未发现明显的杀虫活性。秋粘虫（Spodopterafrugiperda，J.E.Smmith）、烟芽夜蛾（Heliothisvirescens，Fabricius）和亚洲棉铃虫的生物活性测试中，虽致死率与阴性对照相同，但是有明显的体重抑制。125同位素I标记的Cry1Ab蛋白和生物素标记的Cry1Ie2蛋白被用于竞争结125合试验。I-Cry1Ab蛋白在欧洲玉米螟的刷状缘膜微囊泡（Br

6、ushBorderIMembraneVesicles，简称BBMVs）竞争结合试验中，即使在最高的的测定浓度125（未标记的Cry1Ie2蛋白）下，未标记的Cry1Ie2蛋白也无法竞争I-Cry1Ab蛋白与欧洲玉米螟BBMV的结合位点，证明Cry1Ie2蛋白不能识别Cry1Ab蛋白在欧洲玉米螟BBMV中的结合位点。Bio-Cry1Ie2在欧洲玉米螟BBMV上的竞争结合试验进一步证明，Cry1Ab或者Cry1Fa蛋白不能竞争Bio-Cry1Ie2蛋白与欧洲玉米螟BBMV的结合位点。因此，推测Cry1Ie2蛋白与Cry1Ab

7、、Cry1Fa在欧洲玉米螟体内无交互抗性。这些数据支持cry1Ie2可以作为候选基因与cry1Ab或者cry1F一起用于转基因抗虫玉米，从而更好的防治欧洲玉米螟和亚洲玉米螟害虫，同时降低害虫产生抗性的几率。溶解后的欧洲玉米螟BBMV蛋白混合物经分子筛层析分离到不同的收集管中，分布于Peak1、Peak2、Peak3、Peak4、Peak5、Peak6中。通过斑点杂交分析Bio-Cry1Ie1蛋白及Bio-Cry1Ab蛋白与分子筛纯化后BBMV蛋白的结合情况，结果显示Bio-Cry1Ie1蛋白和Bio-Cry1Ab蛋白均可

8、以与收集管C8、C9、C10中的BBMV蛋白结合，而收集管C6、C7、C11中的BBMV蛋白只能与Bio-Cry1Ie1结合。由此我们推测在收集管C6、C7、C11中可能包含某种特殊的受体蛋白仅能够被Bio-Cry1Ie1蛋白识别，不能被Bio-Cry1Ab识别，这可能是Cry1Ie1与Cry1Ab蛋白在欧洲玉米螟体