蜡状芽胞杆菌对芘的生物降解及其降解基因的克隆与表达

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1、暨南大学硕士学位论文题名（中英对照）：蜡状芽胞杆菌对芘的生物降解及其降解基因的克隆与表达BiodegradationofpyrenebyBacilluscereusandcloningandexpressionofdegradinggene作者姓名：卫昆指导教师姓名及学位、职称：尹华博士教授学科、专业名称：工学环境工程学位类型：专业学位论文提交日期：论文答辩日期：答辩委员会主席：论文评阅人：学位授予单位和日期：独创性声明本人A明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成采。除了文中

2、特别加以細注和致谢的地方外.论文屮不包含其他人己经发农或撰写过的研究成果，也不包谗为获得暨南大学或其他教ff'机构的学位或证书而使用过的材料。与我一冋工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作名•签名：签字H期:年6"卜丨学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解暨南大学W关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被A阅和借阅。本人授权暨南大学可以将学位论文的全部或邰分内容编入有关数拋昨进行检索.可以采用影印、缩印

3、或扫描等赵制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：签字FI期:V俾（)月攸1~1学位论文作者毕业后去向：丄作单位：通讯地址：暨南大学硕士学位论文摘要本论文以蜡状芽胞杆菌（Bacilluscereus）为实验菌株，对水体中芘的微生物修复进行了研究，考察其对芘的降解性能，分析其代谢产物和相关功能基因及功能酶，以期从分子生物学角度阐明芘在菌体内的降解机理。B.cereus降解芘的最优无机盐培养基浓度为：K-12HPO4100mg·L，KH2PO4100mg·L-1，

4、MgSO-1-14·7H2O20mg·L和柠檬酸钠100mg·L。在降解体系中加入1mg·L-1Mn2+、0.1mg·L-1Fe3+和10mg·L-1葡萄糖混合物对芘的降解有明显促进作用；1g·L-1菌体在120h内对2.5μmol·L-1芘的降解率达到61.4%。利用LC-MS/MS分析芘代谢产物，检测到1-萘酚、2-萘酚、9-羟基菲和1-羟基芘4种单羟基多环芳烃，表明芘在单加氧酶作用下开环降解，且B.cereus能有效分解利用4种代谢产物，其最高利用率分别为100%，90.3%，98.3%和52.

5、7%。酶活力分析实验结果表明，B.cereus具有的水杨酸羟化酶，邻苯二酚1,2-双加氧酶和邻苯二酚2,3-双加氧酶在芘的降解中起关键作用，其酶活力经芘诱导后均有明显提高。结合产物分析及酶活测定推断B.cereus对芘的降解途径以及降解过程是由单加氧酶和双加氧酶联合起作用。通过设计引物，利用PCR扩增技术，从B.cereus的质粒中克隆出邻苯二酚2,3-双加氧酶（C23O）基因，对其进行序列测定和分析。该基因全长924bp，具有一个完整开放阅读框的序列，编码307个氨基酸氨基酸组成的C23O。理论蛋白

6、分子量为35.16kDa，等电点为5.46。编码区G+C含量为61.8%，A+T含量为38.2%。将该C23O基因序列与NCBI数据库中已收录的其它菌株的C23O基因序列进行比对，分析相关菌属亲缘进化关系，结果显示B.cereus的C23O基因与假单胞菌属（Pseudomonas）菌株C23O基因的相似性最高。利用pET32a(+)质粒对C23O基因构建了重组表达载体，成功在表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。重组菌株酶活检测表明，重组蛋白在表达宿主菌中主要以胞内酶的形式存在。关键词：芘；蜡

7、状芽胞杆菌；代谢产物；邻苯二酚2,3-双加氧酶；基因克隆I暨南大学硕士学位论文AbstractThebiodegradationofpyrenebyabaeterialstrain(Bacilluscereus)werestudiedinthisresearch.Thepyrenedegradationmechanismwasexpectedtobeclarifiedfromabiologicalpointofviewviarevealingthebiodegradabilityofpyrene,th

8、ebiologicalcharacteristicsofbacteriaintheprocessofdegradation,andthroughanalyzingthemetabolite,functionalgenesandenzymesinvolvedinthebiodegradation.Theoptimalconcentrationofinorganicsaltmediumwaslistedasfollows:K-1-1-12HPO4100mg·