CRF-R1在针刺治疗IBS-D中的作用及其介导的肠上皮屏障信号机制研究

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1、中文摘要目的：IBS-D是临床常见病及高发病，以肠道症状合并心理异常为重要临床特征。前期多中心RCT证实针刺不仅能改善肠道症状，而且可以调节心理异常，本研究在此基础上，探讨针刺通过降低CRF-R1在中枢及肠道的表达，抑制TNFα-NFκB-MLCK信号通路的活化，恢复紧密连接结构及功能，从而明确针刺疗效及重建肠上皮屏障的相关机制，为针刺治疗IBS-D提供科学依据。方法：以慢性不可预知性温和应激（CUMS）联合番泻叶浸剂灌胃法建立满足肠道症状合并心理异常的IBS-D大鼠模型。将符合入组标准的大鼠按照体重分层，采用抽签法随机分为对照组、模型组、模型+电针组、模型+药物组及模型+NBI-2791

2、4组。电针组选取天枢、足三里、三阴交、太冲，每次15min。药物组采用2.7mg/mL的匹维溴铵混悬液按10mL/kg灌胃。NBI-27914组给予CRF-R1拮抗剂NBI-27914腹腔注射。14天后以内脏疼痛阈值和腹泻指数评价各组大鼠肠道症状的改变，以高架十字迷宫开臂时间比（OT%）和糖水偏嗜率（SP%）评价各组大鼠焦虑和抑郁样行为的改变。行为学评价结束后取各组大鼠腹主动脉血、下丘脑及结肠段，采用fqRT-PCR法测定下丘脑CRF及CRF-R1mRNA的相对表达水平，免疫荧光双计数法测定IMMC与CRF-R1的双阳性表达细胞数，WesternBlot检测TNFα-NFκB-MLCK信号

3、通路中关键物质的表达水平，免疫组化法检测肠上皮紧密连接蛋白Claudin-1、ZO-1、Occludin的表达，透射电镜法观察肠上皮细胞间连接结构的改变，分光光度法检测血浆DAO活性。结果：给予CUMS联合番泻叶浸剂灌胃14天后，与对照组比较，模型组大鼠内脏疼痛阈值明显降低，腹泻指数显著升高（均P＜0.01），高架十字迷宫开臂时间比（OT%）和糖水偏嗜率（SP%）均明显降低（P＜0.01,P＜0.05），回、结肠均1未见有明显的组织病理形态变化。干预14天后，与模型组比较，电针组、药物组及NBI-27914组内脏疼痛阈值明显升高（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01），腹泻指数显著降低

4、，OT%明显升高（均P＜0.01），而SP%仅电针组和NBI-27914组明显升高（P＜0.05，P＜0.01）。电针组、药物组、NBI-27914组IBS-D大鼠下丘脑CRF及CRF-R1mRNA表达水平均显著降低，IMMC与CRF-R1双阳性表达细胞数显著减少，结肠TNF-α、NF-κB蛋白表达水平及MLC蛋白磷酸化水平蛋白表达水平降低，血浆DAO活性降低，Claudin-1、ZO-1平均光密度值增高（均P＜0.01），Occludin平均光密度值增高（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01），透射电镜下模型组紧密连接结构模糊，黏附连接、缝隙连接和桥粒均不可见；电针组紧密连接和黏附连

5、接结构清晰，但桥粒数量减少；药物组黏附连接、缝隙连接和桥粒的结构较清晰，但紧密连接之间缝隙增大；NBI-27914组紧密连接、黏附连接、缝隙连接和桥粒均清晰可见，桥粒数目较多。此外，在下调结肠NF-κB蛋白表达水平及上调ZO-1方面，电针优于匹维溴铵（均P＜0.01）。结论：1．CUMS联合番泻叶浸剂灌胃法可以成功建立满足肠道症状合并心理异常的IBS-D大鼠模型。2．电针可同时改善IBS-D模型大鼠的肠道症状和心理异常，并且能够重建肠上皮屏障，其抗抑郁、上调ZO-1和下调NF-κB的效果均优于匹维溴铵。3．下调CRF-R1在下丘脑和IMMC上的表达是电针发挥对肠道症状和心理异常双重调节作用

6、的关键靶点。4．抑制CRF-R1介导的TNFα-NFκB-MLCK信号通路活化，上调紧密连接蛋白表达是电针重建肠上皮屏障的重要途径。关键词：电针；IBS-D；CRF-R1；肠上皮屏障；TNFα-NFκB-MLCK信号通路2ABSTRACTObjective:Diarrhea-predominantirritablebowelsyndrome(IBS-D)isacommonclinicaldiseasewithhighincidencewhichmainlycharacterizedbyintestinalsymptomscombinedwithpsychologicaldisorder.O

7、urpreviouspolycentricRCThaveconfirmedthepositiveeffectofEAontreatingbothintestinalandemotionalsymptoms.Ontheclinicalresearchbasis,ourtrialaimsatclarifyingthemechanismofEAonthedualregulationstodisordersofgut-brain