GPR109A介导的丁酸调节猪结肠上皮屏障的作用及其机制

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1、分类号：Ｓ８５２．２１单位代码：１０１８３研究生学号：２０１５８５２００４密级：公开吉林大学硕士学位论文学术学位（）ＧＰＲ１０９Ａ介导的丁酸调节猪结肠上皮屏障的作用及其机制ＥｆｆｅｃｔａｎｄｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｂｕｔｙｒｉｃａｃｉｄｏｎｔｈｅｃｏｌｏｎｉｃｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｂａｒｒｉｅｒｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｍｅｄｉａｔｅｄｂＧＰＲ１０９ＡｉｎＳｕｓｓｃｒｏｆａｙ作者姓名：冯文倩专业：基础兽医学研究方向：动物生理学指导教师：王玮副教授培养单位：动

2、物医学学院２０１８年６月未经本论文作者的书面授权，依法收存和保管本论文书面版本、电子版本的任何单位和个人，均不得对本论文的全部或部分内容进行任何形式的复制、修改、发行、出租、改编等有碍作者著作权的商业性使用（但纯学术性使用不在此限）。否则，应承担侵权的法律责任。吉林大学硕士学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交学位论文，是本人在指导教师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果。对本文的研宄做出重要贡

3、献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：．日期：及以年＜月彡日GPR109A介导的丁酸调节猪结肠上皮屏障的作用及其机制EffectandmechanismofbutyricacidonthecolonicepithelialbarrierregulationmediatedbyGPR109AinSusscrofa作者姓名：冯文倩专业名称：基础兽医学指导教师：王玮副教授学位类别：农学硕士答辩日期：2018年6月3日本研究资助项目国家自然科学基金

4、项目资助NationalNaturalScienceFoundationofChina(NO.31572479)中文摘要GPR109A介导的丁酸调节猪结肠上皮屏障的作用及其机制仔猪断奶后，由于肠道菌群尚未建立完善，肠道屏障发育不健全，应对环境变化的能力弱，应激反应强，致使仔猪发生断奶腹泻。目前治疗腹泻常用的添加剂包括挥发性脂肪酸及其盐类，如丁酸钠。丁酸是纤维素在细菌作用下发生酵解后产生的一种无毒短链脂肪酸，已经被证实能够缓解仔猪断奶后的腹泻率。G蛋白偶联受体109A（GPR109A，HM74A(人)），其不仅在除淋巴细胞外的

5、免疫细胞与脂肪细胞中表达，在上皮细胞、乳腺细胞、神经细胞等均有表达。GPR109A属于Gi偶联型受体，它的内源性配体是β-羟基丁酸（BHBA），烟酸、丁酸等作为外源性配体也可以激活GPR109A。近年的研究表明，GPR109A被配体激活后，在神经退行病、糖尿病、败血症、肥胖、结肠炎、动脉粥样硬化等不同疾病中，能够显著抑制机体的炎症反应，从而可以作为治疗或干预上述疾病的有效靶点。鉴于上述，本项目通过在体和离体实验研究丁酸钠对早期断奶仔猪腹泻的影响，在体实验喂养2000mg/kg丁酸钠21d后观察其对仔猪生产性能的影响，利用HP

6、LC检测小肠乳果糖和甘露醇的排出率，RT-PCR检测各肠段紧密连接蛋白的基因水平表达量，Western-blot检测肠段蛋白表达，Immunofluorescence检测肠段紧密连接蛋白分布情况。离体实验以结肠癌上皮细胞（Caco-2）为模型，利用通路阻断和受体沉默技术，通过RT-PCR、Western-blot等方法检测丁酸钠对结肠上皮细胞紧密连接蛋白的影响。实验结果表明，添加2000mg/kg丁酸钠后，仔猪腹泻率、腹泻指数和腹泻频率显著降低，第一周的平均日增重（ADG）和饲料增重率显著高于对照组，尿液中乳果糖和甘露醇比值

7、显著低于对照组，这表明丁酸钠能够降低肠道通透性，提高肠道完整性。同时，丁酸钠能够降低结肠中炎性因子TNF-α的表达量并显著提高结肠部位紧密连接蛋白Claudin-3、Occludin和ZO-1以及GPR109A受体的表达，且伴随着ERK1/2、P38、Akt信号通路的激活。I选择1.5mM的丁酸钠刺激Caco-2细胞，利用GPR109A-shRNA质粒沉默Caco-2细胞中的GPR109A，利用10μMMK2206（Akt抑制剂）抑制Akt后，丁酸钠促进Caco-2细胞中的紧密连接蛋白Claudin-3表达的效应得到抑制，但

8、是10μMU0126（ERK的高度选择性抑制剂）和10μMSB203580（P38特异性抑制剂）对Caco-2细胞中的紧密连接蛋白Claudin-3的表达无明显影响。以上结果表明，丁酸钠可以通过激活结肠上皮细胞GPR109A和Akt信号通路，提高Claudin-3的表达，从而提高结肠部位的