运用代谢组学技术研究抗生素对糖尿病晚期大鼠代谢表型的影响

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分类号：R9单位代码：10343学号：151005809硕士学位论文论文题目:运用代谢组学技术研究抗生素对糖尿病晚期大鼠代谢表型的影响研究生姓名：汤胜利学科专业：药学类型：学术型指导教师：高红昌教授郑宏副研究员二O一八年五月 论文题目：运用代谢组学技术研究抗生素对糖尿病晚期大鼠代谢表型的影响答辩委员会主席：姜潮教授温州大学答辩委员会成员：初彦辉教授温州大学丛维涛研究员温州医科大学田海山副研究员温州医科大学论文答辩日期：2018年5月20日 温州医科大学硕士学位论文目录中文摘要......................................................................................................3Abstract........................................................................................................5引言..............................................................................................................71实验材料...............................................................................................91.1实验动物......................................................................................91.2实验仪器和耗材..........................................................................91.3实验试剂......................................................................................92实验方法.............................................................................................102.1实验分组及抗生素给药............................................................102.2Morris水迷宫行为学实验.......................................................102.3微生物群落多样性分析............................................................112.4核磁共振代谢组学技术分析....................................................122.4.1样本收集和制备...............................................................122.4.21H-NMR图谱采集与分析...............................................122.5统计学分析................................................................................133结果......................................................................................................133.1抗生素对糖尿病晚期大鼠体重及血糖的影响.......................133.2抗生素对糖尿病晚期大鼠学习记忆的影响............................143.3抗生素对糖尿病晚期大鼠肠道菌群种类的影响...................151 温州医科大学硕士学位论文3.4抗生素对糖尿病晚期大鼠代谢模式的影响............................154分析与讨论.........................................................................................304.1抗生素导致糖尿病晚期大鼠学习记忆受损............................304.2抗生素导致糖尿病晚期大鼠菌群代谢紊乱............................304.3抗生素导致糖尿病晚期大鼠能量代谢紊乱............................314.4抗生素导致糖尿病晚期大鼠氨基酸代谢紊乱.......................325总结......................................................................................................33参考文献....................................................................................................34附录............................................................................................................42致谢............................................................................................................43综述及参考文献.......................................................................................44学位论文独创性声明...............................................................................612 温州医科大学硕士学位论文运用代谢组学技术研究抗生素对糖尿病晚期大鼠代谢表型的影响中文摘要糖尿病（diabetesmellitus，DM）是由于胰岛细胞破坏导致胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗引起的以高血糖为主要特征的慢性代谢性疾病。近些年其发病率逐渐上升，被认为是继心血管疾病、肿瘤之后第三大危害人类健康的疾病。如果控制不当，发展到疾病晚期，机体会出现多种合并感染，严重者可能会致残、致死，给社会以及家庭带来严重的经济负担，即使血糖控制良好，晚期糖尿病患者仍有可能出现严重感染。目前临床上针对糖尿病晚期严重感染多数采用抗生素（如万古霉素，环丙沙星）辅助治疗。然而，研究表明糖尿病晚期使用这些抗生素可能会进一步加重病情，主要原因是机体肠道内部的菌群稳态失衡。此外，随着肠脑轴研究的不断深入，实验结果表明脑认知功能受损和抗生素使用密切相关。代谢组学作为一门相对较新的技术，能够在疾病或药物干预的情况下，对生物样本中的小分子代谢物进行全面分析。核磁共振波谱法是代谢组学中最为常见的分析方法，具有样本制备简单、高效、高重现性等优点广泛用于药物或疾病研究。本实验中，我们使用抗革兰氏阳性菌的万古霉素和抗革兰氏阴性菌的环丙沙星+甲硝唑（联用）对正常和STZ诱导糖尿病晚期大鼠进行干预，利用Morris水迷宫实验考察抗生素对正常和糖尿病晚期大鼠的学习记忆影响。空间探索实验显示正常大鼠给予抗生素干预后的穿台次数、目标象限路程以及时间百分比均明显下降，糖尿病组间只有万古霉素干预组中的相应指标出现下降，这表明正常大鼠受到抗生素干预后，其认知功能出现损伤，而糖尿病大鼠的学习记忆能力受万古霉素影响较大。群落分析结果表明抗生素干预后，正常和糖尿病大鼠肠道内厚壁杆菌门（革兰氏阳性菌）的数量出现下降。随后我们收集了所有组别的的粪便、结肠、肝脏、血液以及海马样本进行核磁共振代谢组学技术分析，结果发现万古霉素干预后，在正常以及糖尿病大鼠的粪便和结肠中发现菌群代谢产物乙酸、丁酸（源于厚壁杆菌发酵）的含量显著下降，这表明菌群的代谢发生紊乱。除此之外，机体中血液和肝脏的相关代谢也受到一定程度的影响。正常大鼠在万古霉素干预后，血液和肝脏中的能量代谢物质含量下降，如乳酸、葡萄糖、乙酸和肌酸；氨基酸代谢物质含量上升，如亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸等。海马样本中能量和氨基酸代谢相关物质未发生显著性变化。糖尿病大鼠在万古霉素干预后，粪便中的菌群代谢物质含量下降，如乙酸、丁酸；氨基酸代谢物质含量下降，如谷氨酸、3 温州医科大学硕士学位论文甘氨酸等；能量代谢物质葡萄糖含量下降；结肠中氨基酸代谢物质含量上升，如谷氨酸、谷氨酰胺；肝脏中氨基酸代谢物质含量上升，如谷氨酸、谷氨酰胺等；能量代谢物质含量下降，如琥珀酸、肌酸等；血液和海马样本中的相关代谢均未发生明显变化。综上所述，我们发现正常大鼠在抗生素干预后，认知功能出现障碍，在糖尿病大鼠中万古霉素干预后也出现了认知损伤。菌群数据发现正常和糖尿病大鼠给予万古霉素后，肠道内厚壁杆菌门的数量下降。代谢数据表明，正常大鼠给予万古霉素后，结肠和粪便中的菌群代谢发生紊乱；肝脏和血液中的能量以及氨基酸代谢出现紊乱。糖尿病大鼠给予万古霉素后，结肠和粪便中的菌群代谢，能量代谢以及氨基酸代谢发生紊乱；肝脏中的氨基酸代谢和能量代谢也发生改变；海马和血液中的相关代谢未发生显著性变化。本研究借助代谢组学技术全面分析了抗生素对正常和糖尿病大鼠的代谢影响，为临床上糖尿病晚期患者合理使用抗生素提供新的参考价值。关键词：糖尿病；抗生素；肠道菌群；代谢组学4 温州医科大学硕士学位论文InvestigationofMetabolicPhenotypeofAntibioticsonLateDiabeticRatsBasedonMetabonomicAnalysisAbstractDiabetesmellitus(DM)isachronicmetabolicdiseasecharacterizedbyhyperglycemiaduetothedestructionofisletcellorinsulinresistance.Inrecentyears,itsincidenceisgraduallyincreasingintheworld.Itisconsideredtobethethirddiseaseendangeringhumanhealthaftercardiovasculardiseaseandtumor.Ifnotcontrolledproperly,thebodywilloccurmultiplecombinedinfectionsinthelatestage.Seriously,itmaycausedisabilityanddeathandwillbringaseriousfinancialburdentosociety.Eveniftheglucoseiswellcontrolled,patientswithadvanceddiabetesmaystillhaveseriousinfections.Currently,thecommontreatmentoflatediabetespatientswithseverinjectionuseantibiotics(suchasvancomycin,ciprofloxacin)adjuvanttherapy.However,studieshaveshownthattheuseoftheseantibioticsinthelatestageofdiabeteswillmakethediseaseaggravated,themainreasonistheimbalanceofthebacterialflorainthegut.Inaddition,withthein-depthstudyofgut-brainaxis,theresultsshowthatthereisacloselinkbetweencognitiveimpairmentandtheuseofantibiotics.Metabolomics,asanewtechnology,providesacomprehensiveanalysisofsmallmoleculemetabolitesinbiologicalsamplesunderthediseaseordrugintervention.Nuclearmagneticresonancespectroscopyisthemostcommonanalyticalmethodinmetabonomics.Ithasbeenwidelyusedindrugordiseaseresearchwiththeadvantagesofsimplesamplepreparation,highefficiencyandreproducibility.Inthisstudy,weusedvancomycin(againstGram-positivebacterial)andciprofloxacin+metronidazole(againstGram-negativebacterial)tointervenethenormalanddiabetesrats.WeinvestigatedtheeffectofantibioticsonthelearningandmemorybyMorriswatermazetest.Spaceexplorationshowedthatthenumberofcrossingtheplatform,thepercentageoftargetquadrantlengthandtimesignificantlydecreasedinnormalratsafterintervention,theaboveindicatorsdecreasedbyvancomycinindiabetesrats.Itindicatesthattheabilityoflearningandmemoryisdamagedafterantibioticsinterventioninnormalratsandinthediabetesrats,thevancomycingroupismoreserious.TheresultsofcommunityanalysisshowedthattherewasadeclineinthenumberofBacteroidetes(Gram-positive5 温州医科大学硕士学位论文bacterial)innormalanddiabeticsratsaftervancomycinintervention.Then,wecollectedfeces,colon,liver,bloodandhippocampalsamplesforNMRmetabonomicanalysis.Theresultsshowedthatthebacterialmetabolitesacetateandbutyrate(derivedfromthefermentationofBacteroidetes）decreasedinfecesandcolonsamplesofnormalanddiabeticsratswithantibioticsintervention.Inaddition,themetabolismofothertissueswasalsoaffected.Aftertheinterventionofvancomycininnormalrats,thecontentofenergymetabolismsubstancesdecreasedinthebloodandliver,suchaslactate,glucose,acetateandcreatine;thecontentofaminoacidmetabolitesraised,suchasleucine,isoleucine,valine,3-hydroxybutyrate,acetoacetate,N-acetylasparte,glutamate,tyrosine.Therewasnosignificantchangebetweentheenergyandaminoacidinthehippocampus.Aftertheinterventionofvancomycinindiabetesrats,infeces,thecontentofmetabolitesdecreased,suchasacetate,butyrateandthecontentofaminoacidmetabolitesdecreased,suchasglutamateandglycineandglucose,theenergymetabolizingsubstancedecreased;Incolon，Aminoacidmetabolitesincreased,suchasglutamate,glutamine;Inliveraminoacidmetabolitesdecreased,suchas3-hydroxybutyrate,betaine,succinateetcandenergymetabolismsubstancesdecreased,suchassuccinate,creatineetc.Therewasnosignificantchangebetweentherelativemetabolismofbloodandhippocampussamples.Insummary,wefoundthatthecognitivefunctionwasimpairedafterantibioticsinterventioninnormalrats.Aftertheinterventionofvancomycinindiabeticsrats,thecognitiveimpairmentisaggravated.Microbialdatarevealedthatafterthevancomycinintervention,thenumberofFirmicutesweredecreasedinnormalanddiabeticsrats.Metabolicdatashowedthatthenormalratswhichweregivenvancomycin,themicrobialmetabolismwasdisorderedinthecolonandfeces;theenergyandaminoacidmetabolismweredisorderedintheliverandblood.Indiabeticsratswhichweregivenvancomycin,thebacterialmetabolism,energymetabolismandaminoacidmetabolismweredisordered.Inthecolonandfecessamples,aminoacidandenergymetabolismweredisorderedintheliver.Inthisstudy,analyzingthemetaboliceffectsofantibioticsonnormalanddiabeticratsbyusingmetabonomicstechnique,providesanewreferencevalueforrationaluseofantibioticsinpatientswithadvancedstageofdiabetes.Keywords:Diabetes;Antibiotics;Intestinalflora;Metabonomics6 温州医科大学硕士学位论文引言糖尿病是由于胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗引起的以高血糖为主要特征的常见慢性代谢性疾病。根据世界卫生组织预测，到2030年，全球患病人数将高达5.52亿[1]，且患病人数将继续增加。若控制不当，糖尿病发展到晚期，会产生一系列严重感染等并发症，给社会及家庭带来严重的经济负担。目前糖尿病晚期并发症的影响因素主要包括遗传因素[2]和环境因素[3]，而环境因素又包括炎症反应[4]、药物[5]、饮食[6]等。然而，由于机体系统的复杂性以及疾病的不稳定性，使得目前临床上针对糖尿病晚期合并感染等症状多采用抗生素辅助治疗。文献报道肠道菌群和糖尿病之间存在某种联系。Nakayama等将NOD糖尿病小鼠和菌群稳态失衡小鼠共同饲养一段时间后发现NOD小鼠对糖尿病的易感性较低，造成这种现象的原因是NOD小鼠肠道中产生调节性T细胞的菌群数量增多，进而改善糖尿病的敏感性[7]。Tang等利用治疗人类糖尿病的抗体来干预糖尿病晚期小鼠，结果同样发现体内调节性T细胞的菌群数量增多，并且这些T细胞具有一定活性，能够抑制由炎症反应激活的糖尿病发生[8]。Wu等通过对经典药物二甲双胍改善糖尿病小鼠的机制进行研究，发现二甲双胍对肠道微生物的组成有着较强的干预效果，将药物干预组的粪便样本移植到无菌糖尿病鼠内，其对葡萄糖的耐受性明显改善[9]。Warrier等通过对三甲胺（TMO）改善糖尿病晚期症状的代谢机制研究发现肠道内产生该类代谢物的梭菌门数目上升[10]。Bäckhed等提出肠道菌群的组成改变能够影响大鼠的脂肪和能量代谢，进而影响糖尿病病情，其原因是肠道菌群通过抑制禁食诱导脂肪因子(Fiaf)的表达，使肠上皮细胞内的脂蛋白酶（LPL）活性增加，促进脂肪聚集[11]。肝脏中的初级胆汁酸释放进入肠道，在结肠内部细菌的作用下形成次级胆汁酸，激活法尼醇x受体(FXR)，产生FGF19，抑制胆固醇7羟化(CYP7A1)活性，调节脂质及血糖代谢[12]。如果肠道菌群内的梭菌门，双歧杆菌门数目增多，肝脏内胆汁酸合成将被抑制，使得机体糖脂代谢发生紊乱，进而诱发或加重糖尿病[13]。短链脂肪酸作为厚壁杆菌，罗氏菌门的主要发酵产物，通过激活G-蛋白偶联受体（GPR41，GPR43）促进肠道胰高血糖素样肽-1(GLP-1)和酪酪肽(PYY)的释放，改善糖尿病[14]。研究称该类菌群的组成紊乱可能会导致短链脂肪酸水平发生改变，从而加重糖尿病病情[15]。以上资料充分证实肠道菌群的变化对糖尿病晚期病情的发展有着直接联系。抗生素是诱导菌群稳态发生改变的主要因素[16]。目前临床上将抗生素分为抗革兰氏阳性菌和阴性菌两大类[17]。研究报道抗革兰氏阳性菌的硫酸粘菌素以及抗革兰氏阴性菌的甲氧苄氨嘧啶干预BB-DP小鼠（糖尿病模型鼠）一周后，小鼠体内7 温州医科大学硕士学位论文的血糖明显下降，对葡萄糖的敏感性也显著提高。菌群分析结果发现拟杆菌门（革兰氏阴性菌）数目显著下降[18]。Schlamm等利用磺胺甲恶唑对高脂饮食形成的糖尿病大鼠进行干预，结果发现大鼠血浆中葡萄糖值下降到常规水平[19]。但是，也有文献报道指出抗生素的使用加重糖尿病晚期病情。Boursi等对STZ诱导的糖尿病小鼠给予抗生素一周后，发现肠道内的菌群组成发生紊乱，一些和糖尿病和肥胖相关基因的表达也发生变化，使得糖尿病病情加重[20]。Livanos等报道抗生素的使用，尤其是抗革兰氏阳性菌，能够加重STZ诱导的糖尿病小鼠疾病[21]。Cani等利用抗生素分别对STZ诱导的糖尿病和高脂饮食诱发的肥胖大鼠进行干预，结果发现糖尿病和肥胖大鼠体内菌群衍生物脂多糖（LPS）的水平显著下降，糖耐量实验显示糖尿病大鼠对血糖的敏感性增加[22]。Bach等利用抗生素对非肥胖（NOD）糖尿病鼠进行干预，发现小鼠肠道内炎症相关因子表达受到抑制，小鼠病情得到缓解[23]。Tormo-Badia等利用甲硝唑和新霉素联用对NOD妊娠期糖尿病小鼠进行干预，发现NOD小鼠的糖尿病病情加重，并且在后代小鼠中也出现了糖尿病[24]。以上论述表明抗生素对糖尿病晚期大鼠病情的发展有着直接关系。代谢组学作为一门正在发展的“组学”技术，能够在机体受到刺激如疾病或药物干预情况下，对生物体内的组织或体液代谢物变化进行全面系统分析[25]。核磁共振波谱法作为一种常用的代谢组学分析方法，凭借生物样本需求量少、制作简单分辨率高以及快速测定等优势，广泛应用于药理药动学机制研究、生物标志物鉴定等方面，为疾病的预防和诊断提供准确信息[26]。利用该技术，我们分别选用万古霉素（抗革兰氏阳性菌）和环丙沙星+甲硝唑（抗革兰氏阴性菌）干预糖尿病大鼠，通过对大鼠粪便、结肠、肝脏、血液以及海马样本进行研究。从代谢的角度探究抗生素对糖尿病大鼠的影响。8 温州医科大学硕士学位论文1实验材料1.1实验动物雄性大鼠体重180-200g，购买于上海斯莱克实验动物有限公司，饲养于温州医科大学实验动物中心SPF级动物房（温度25±2℃，湿度55%—70%），从早上8:00开始交替照明12小时，整个饲养过程动物自由饮水、饮食。所有操作均严格遵循温州医科大学实验动物护理和使用手册。1.2实验仪器和耗材600MHz核磁共振谱仪BrukerBioSpinInternationalAG低温冰箱青岛海尔公司超低温冰箱（-80℃）美国Thermo公司SCIENTZ-48高通量组织研磨器宁波新芝生物科技股份有限公司电子分析天平瑞士MettlerToledo公司低温高速离心机德国Eppendorf公司Milli-Q超纯水系统美国Millipore公司pH计瑞士MettlerToledo公司涡旋仪美国Thermo公司移液器德国Eppendorf公司电热恒温干燥箱上海跃进医疗器械厂血糖仪、血糖试纸美国Millipore公司冷冻干燥机德国MarinChrist公司液氮罐美国Thermo公司水迷宫上海欣曼科教设备有限公司1.3实验试剂链脲佐菌素（STZ）Sigma-Aldrich（美国）公司2,2,3,3-三甲基甲硅烷基丙酸（TSP）Sigma-Aldrich（美国）公司柠檬酸、柠檬酸钠上海国药集团化学试剂有限公司水合氯醛上海国药集团化学试剂有限公司甲醇、乙醇、氯仿、氯化钠上海国药集团化学试剂有限公司9 温州医科大学硕士学位论文二甲苯上海国药集团化学试剂有限公司中性树胶上海国药集团化学试剂有限公司万古霉素美国Amresco公司甲硝唑美国MYM公司环丙沙星Sigma-Aldrich（美国）公司1.5ml、4mlEP管江苏碧云天生物技术研究所锡箔纸江苏碧云天生物技术研究所医用生理盐水江苏碧云天生物技术研究所PBS江苏碧云天生物技术研究所D2O（99.9％氘代）剑桥同位素实验室5mm核磁管德国Bruker公司2实验方法2.1实验分组及抗生素给药雄性大鼠适应性饲养一周后随机分成糖尿病和正常组。禁食12h后糖尿病组大鼠按体重分别单次腹腔注射剂量65mg/kg的链脲佐菌素（STZ）柠檬酸钠混悬溶液，正常组给予等体积的柠檬酸钠溶液，自由饮水3小时后给予正常饮食。三天后测其血糖变化，当大于16.7mmol/L视为造模成功。随后将正常大鼠随机分成正常组和抗生素给药组，糖尿病大鼠分组同上。将抗生素溶于生理盐水中配置成浓度为1.5mg/ml溶液，在造模成功后第8周，给药组大鼠每天2次灌胃10ml/kg剂量的抗生素（早上8:00和下午16:00），持续两周，正常和糖尿病组给予等体积的生理盐水[27]。在整个饲养过程中，我们详细记录第1、2、5、8以及11周体重和血糖变化。2.2Morris水迷宫行为学实验抗生素干预后，每组选用部分大鼠进行Morris水迷宫实验，用以考察抗生素对大鼠学习记忆能力影响。根据文献[28-29]报道的方法实施，具体描述如下：设备包括直径100cm，高50cm的圆形迷宫，一套计算机数据采集系统再加高清摄像头。将平台置于第三象限底部凹槽。随后筒壁按东西南北四个方向标识Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四个象限区。实验的开展地方选择相对密闭且隔音效果较好。无明显10 温州医科大学硕士学位论文外界干扰环境。此外，保证光源位置，强度等参数不变。随后开始注水，水位约为平台顶端1cm处，开启空调保持水温27±1℃，然后打开电脑控制系统，设置平台、水池相应参数，记录时间60s。从任意象限开始计时，利用计算机摄像系统自动检测大鼠行动轨迹，并通过软件分析得到数据。实验共进行5天，前4天为定位航行实验（训练期），最后一天空间探索实验（测试期）。测试期间，每只大鼠每天按照东西南北四个方位进行4个象限的轨迹实验（13:00-16:30），记录时间60s，第5天为测试实验，撤去平台，观察大鼠的穿台次数、目标象限路程、时间百分比，记录时间60s。图像分析和数据收集由计算机自动完成。利用相应软件识别平台寻找轨迹图。具体操作流程如下：定位航行实验（测试期）：测试期的目的是让大鼠寻找并记住平台的位置（第三象限Ⅲ内）。每组选取大鼠若干，适应性游泳一段时间后将每只大鼠尾部提取，头面壁，缓缓放入池中，另外一人在电脑旁控制，当大鼠找到平台并爬上去（不会掉下来）结束监控记录，计时15s后取出，如果大鼠60s内还未找到平台，我们会将其引至平台上停留15s，然后进行下一只训练。所有大鼠均按照东南西北四个方向依次进行，以保证大鼠得到充分的休息时间，值得注意的是每次起点方向需不同。这4天我们主要训练大鼠对平台位置的记忆。空间探索实验（测试实验）：在第5天我们撤去平台，选择距离平台最远的北方，将所有大鼠依次从该方向内壁缓慢放入水中，任其自由游泳60s，记录穿台次数（摄像头对应的投影）、目标象限时间以及路程百分比参数。2.3微生物群落多样性分析微生物群落多样性分析是对微生物群体进行高通量测序。主要的研究对象是特定序列的构成分析，特定环境中微生物群体的构成情况或基因组成，借助不同环境下微生物群落的构成差异构成，我们可以分析微生物与环境或宿主之间的关系，寻找差异菌群[30-31]。该部分采用HiSeq2500高性能测序仪器对样本进行16SrDNA扩增测序，分析不同组别间的菌群多样性变化（北京诺禾致源科技股份有限公司承担）。每组选取0.5g或以上的粪便样本，编号后，置于干冰中运输保存，用以减少外界环境影响。取检测合格的样本建库，随后以V4区为扩增片段对样本进行SE400/600测序，最后信息分析。利用OTU（operationaltaxonomicunits）分类等级对样本进行区分。即每个OTU对应于一个不同的细菌（微生物）种[32-33]。通过OTU分析，我们可以看出细菌群落的多样性变化，进而找出差异菌群。11 温州医科大学硕士学位论文2.4核磁共振代谢组学技术分析2.4.1样本收集和制备大鼠处死前24h内利用鼠笼收集所有组别新鲜粪便样本，迅速做好标记暂置于液氮中速冻，待全部收集完毕后转移至-80℃冰箱保存备用。随后所有大鼠禁食过夜，采用断头处死方式，收集海马、结肠、肝脏、血液样本。其中，收集的新鲜血液样品置于冰上15min，离心（3000g，4℃，15min），吸取血清，密封保存-80℃备用。立即离心的目的是防止溶血现象发生。剩余组织分别放入已标记好的冻存管中，迅速投入液氮速冻，密封保存-80℃冰箱备用。粪便制备采用水-磷酸盐缓冲液提取法提取水溶性分子[34-35]。样本称重后按照M/V=1:2的比例加入相应的磷酸盐缓冲液（pH=7.4），涡旋，于冰上静置10min，离心（4℃，10000g，15min），取上清密封保存。海马，肝脏以及结肠采用甲醇-氯仿-水提取法[36-37]，按照4:2.85:4的比例加入相应溶剂，密封，放置高通量粉碎机（60HZ,1min）粉碎，涡旋，于冰上静置15min，离心（4℃，5000g，15min），吸取上清水溶性代谢物，液氮预冻后放入冷冻干燥机冻干（48h），得到组织粉末。封口保存。解冻后的血清吸取250μL加入200μL磷酸盐缓冲液（pH=7.4）及50μL的D2O，涡旋、离心（4℃，12000g，10min），取上清，转移至5mmNMR样品管中用于NMR分析。此外，取粪便上清300μL加入200μLD2O（0.1mMTSP），涡旋、离心，转移至5mmNMR样品管中备用。冻干的样本分别加入500μLD2O（0.02mMTSP），涡旋、离心，转移到5mmNMR样品管中备用。2.4.21H-NMR图谱采集与分析所有1H-NMR图谱采集均使用本实验室BrukerAVANCEⅢ600MHz超导高分辨核磁共振谱仪。血清样本采用一维CPMG序列，以减少血脂、蛋白质对谱峰影响。剩余组织均采用ZGPR标准脉冲序列，用预饱和方式压制水峰。具体参数如下：采样标准温度298K，谱宽12000Hz，数据采集点数32K，弛豫延迟4s，累加次数128次，每次扫描时间2.65s。采集的所有图谱均采用BrukerTopspin2.1软件进行基线以及相位调整，血清样本以乳酸峰定标（δ1.33），剩余样本均以TSP峰定标（δ0.00）[38-39]。为了使代谢物定位更为准确，借助Topspin2.1软将所有样本谱图导成数据，利用MATLABR2010软件（美国MathWorks公司）12 温州医科大学硕士学位论文对齐谱图，对谱峰δ-1~8.0ppm以0.01ppm和0.0015ppm为间隔进行自动积分[40-41]。为了消除水峰和溶剂峰的影响，我们将水峰（δ4.6~5.20ppm）以及甲醇峰（δ3.33）置零。最后，将0.01和0.0015区间的的积分值进行归一化处理[42-43]。将0.01为区间得到的积分值导入SIMCA-P+12.0软件（瑞典Umetrics公司）进行模式识别分析。其中，正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）是一种多变量的监督模型，以第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）作为X，Y轴，得到Scoreplot和S-Plot图。每一个点代表一个样本。OPLS-DA模式识别分析用于留一交叉验证（Theleave-one-outcross-validation，LOOCV），其中R2和Q2表示模型的拟合度和预测能力，说明该模型越可靠。利用得分可准确反映不同组别之间的代谢模式差异，S-Plot图可找出对这种差异有较大贡献的代谢物。2.5统计学分析应用SPSS21.0统计软件进行统计学分析，数据结果以均值±标准差表示（M±SD）。两组间比较采用独立样本T检验，多组建比较采用单因素方差分析（one-wayANOVA），P<0.05被认为具有统计学差异。3结果3.1抗生素对糖尿病晚期大鼠体重及血糖的影响本实验中，我们详细记录了第1（开始）、2（STZ造模）、5（造模期间）、8（抗生素干预）以及11周（处死前）的体重和血糖数据，如图1所示，其中A图和B图分别表示体重和血糖变化，从图中我们可以无论是正常大鼠还是糖尿病晚期大鼠，抗生素干预后均未出现明显变化。图1抗生素干预后的大鼠体重（A）和血糖（B）变化。C：正常组；DM：糖尿病组；CV：13 温州医科大学硕士学位论文正常大鼠万古霉素干预组；DMV：糖尿病大鼠万古霉素干预组；CCM：正常大鼠环丙沙星+甲硝唑干预组；DMCM：糖尿病大鼠环丙沙星+甲硝唑干预组。3.2抗生素对糖尿病晚期大鼠学习记忆的影响为了考察糖尿病晚期大鼠在抗生素干预后的空间学习记忆变化，我们在不同组别随机选取若干只大鼠进行Morris水迷宫实验，图2为相应的水迷宫实验结果，其中图2A是大鼠空间探索实验的游泳轨迹图，图2B-2D分别代表实验大鼠在空间平台探索中的穿越次数、目标象限路程和时间百分比。从图2A我们可以看出，抗生素干预正常组大鼠的游泳轨迹明显差异，在糖尿病大鼠中，只有万古霉素干预组中的的轨迹出现差异。从图2B中我们发现正常大鼠抗生素干预后，穿台次数明显较少（p<0.01），在糖尿病大鼠中，万古霉素干预组中的的穿台次数减少（p<0.05）。图2C-2D我们发现抗生素干预正常大鼠后的目标象限路程和时间百分比显著性降低（p<0.05），糖尿病大鼠中，只有万古霉素组的相关参数下降（p<0.05）。以上结果说明正常大鼠无论给予万古霉素还是联用抗生素，其空间学习记忆能力都出现下降，而糖尿病晚期大鼠学习和记忆能力受万古霉素影响较大。14 温州医科大学硕士学位论文图2正常和糖尿病大鼠在抗生素干预后的Morris水迷宫结果。A为代表性游泳轨迹图。B-D分别为60s内穿台次数、目标象限路程百分比、目标象限时间百分比。C，DM分别表示正常组，糖尿病组；CV，DMV表示万古霉素干预组；CCM，DMCM表示环丙沙星+甲硝唑干预组。显著性水平：*p<0.05；**p<0.01。3.3抗生素对糖尿病晚期大鼠肠道菌群种类的影响为了考察糖尿病晚期大鼠在抗生素干预后肠道菌群种类的变化，我们将收集到的粪便样本进行微生物测序分析。如图3所示，我们发现厚壁杆菌门（红色标识）、拟杆菌门（蓝色标识）、变形菌门（深绿色）、梭菌门（粉色）以及疣微菌门（橙色）的变化最为明显。具体表现为万古霉素和联用抗生素干预后，糖尿病大鼠肠道内厚壁杆菌数量均出现减少，拟杆菌数量增多，此外，对正常大鼠而言，我们发现万古霉素干预后，肠道内厚壁杆菌和拟杆菌数目下降，变形菌的数量增多，联用组抗生素干预后，拟杆菌的数量增加。厚壁杆菌的数目变化出现下降。15 温州医科大学硕士学位论文图3抗生素干预后正常和糖尿病大鼠肠道内Top10菌群分析（OTU分类）。Firmicutes：厚壁杆菌门；Bacteroidetes：拟杆菌门；Proteobacteria：变形菌门；verrucomicrobium：疣微菌门；Fusobacteria：梭杆菌门；Actinobacteria：放线菌门；Cyanobacteria：蓝细菌门；Tenericutes：软壁菌门；Acidobacteria：酸杆菌门；Ahloroflexi：绿弯菌门；Others：未能检测到的菌群。C，DM分别表示正常组，糖尿病组；CV，DMV表示万古霉素干预组；CCM，DMCM表示环丙沙星+甲硝唑干预组。3.4抗生素对糖尿病晚期大鼠代谢模式的影响3.4.1大鼠样本1H-NMR图谱图4是大鼠各样本典型的1H-NMR图谱，其中A图为粪便样本，B图结肠样本，C图肝脏样本，D图血清样本，E图海马样本。图4A-图4E中均归属出能量代谢产物中的乳酸（Lactate）和氨基酸代谢中的丙氨酸（Alanine）。图4A-图4D中均归属出支链氨基酸代谢相关产物亮氨酸（Leucine）、缬氨酸（Valine）、异亮氨酸（Isoleucine）。图B-图E中都归属出能量代谢产物中的琥珀酸（Succinate），肌酸（Creatine），氨基酸代谢产物中的谷氨酸（Glutamate）、谷氨酰胺（Glutamine），甲胺代谢产物中的胆碱（Choline）。图4B-图4D中均归属出能量代谢产物中的葡萄糖（Glucose）。图4C-图4E归属出能量代谢产物中的葡萄糖（Glucose）。图A-图B中都归属出菌群代谢产物乙酸（Acetate）、丙酸（Propionate）、丁酸（Butyrate）、尿嘧啶（Uracil），氨基酸代谢产物中的酪氨酸（Tyrosine）、苯丙氨酸（Phenylalanine）。图B，图E中均归属出能量代谢产物中的一磷酸腺苷（AMP），渗透压调节物肌酸（Creatine）、牛磺酸（Taurine）。图C，图E中均归属出氨基酸代谢产物中的肌氨酸（Sarcosine）、16 温州医科大学硕士学位论文N-N-二甲基甘氨酸（N-N-dimethylglycine）。除了以上共有的，我们又分别归属出每个样本特有的代谢物，图B中氨基酸代谢产物黄嘌呤（Xanthine），图C中氨基酸代谢物甜菜碱（Betaine），图D中的能量代谢产物丙酮酸（Pyruvate），氨基酸代谢产物柠檬酸（Citrate），脂质代谢产物低密度脂蛋白/极低密度脂蛋白以及酮体代谢产物中的乙酰乙酸（Acetoacetate）。图E中的氨基酸代谢产物N-乙酰天门冬氨酸（NAA）、兴奋性神经递质代谢γ-氨基丁酸（GABA）。图4大鼠粪便（A）、结肠（B）、肝脏（C）、血清（D）以及海马（E）样本典型的1H-NMR谱。1丁酸；2亮氨酸；3缬氨酸；4异亮氨酸；5丙酸；6乳酸；7丙氨酸；8乙17 温州医科大学硕士学位论文酸；9酪氨酸；10苯丙氨酸；11尿嘧啶；12黄嘌呤；133-羟基丁酸；14谷氨酸；15琥珀酸；16谷氨酰胺；17天门冬氨酸；183-甲胺；19肌酸；20胆碱；21牛磺酸；22肌醇；23甘氨酸；24α-葡萄糖；25肌苷；26一磷酸腺苷；27延胡索酸；28组氨酸；29二甲基甘氨酸；30肌氨酸；31N-N-二甲基甘氨酸；32甜菜碱；33葡萄糖；34β-葡萄糖；35低密度脂蛋白/极低密度脂蛋白；36脂质；37乙酰乙酸；38丙酮酸；39柠檬酸；40γ-氨基丁酸；41N-乙酰天门冬氨酸。3.4.2抗生素对糖尿病晚期大鼠代谢模式的影响为了考察抗生素对糖尿病晚期大鼠代谢模式的变化，我们基于1H-NMR代谢组学数据进行OPLS-DA模型分析，如图5所示，所有正常和糖尿病大鼠之间代谢模式有着明显的区分，说明具体分析如下：3.4.2.1抗生素对糖尿病晚期大鼠粪便样本代谢模式的影响从图5A粪便样本的OPLS-DA得分图中，我们可以看出正常大鼠和糖尿病大鼠的代谢差异较为明显，沿PC2方向分开，说明两者的代谢模式不同。此外，正常组大鼠间的代谢模式存在差异，糖尿病大鼠中只有万古霉素组干预组出现代谢差异。根据OPLS-DA模型的R2、Q2以及相应P值（表1），我们发现正常组，糖尿病组，糖尿病万古霉素干预组模型较为可靠，依此信息我们做了相应的得分图和S-Plot图（图6）。从图6A左边我们发现正常组和糖尿病组大鼠在PC1方向明显区分，说明两组间代谢模式存在明显差异，主要因为丙酸、丁酸、琥珀酸，乙酸、丙氨酸、谷氨酸的含量变化导致，如图6A右边所示。图6B左边糖尿病组和糖尿病万古霉素干预组的代谢模式有明显差异，相应的S-Plot图我们发现是因为乙酸、丁酸、丙酸、乳酸、丙氨酸等代谢物含量变化造成的，由于S-plot图只能反映不同组别间代谢物上升或下降水平，具体的含量水平我们很难看出，因此，我们做了相应的的定量柱状图，如图7所示。18 温州医科大学硕士学位论文图5大鼠各样本的得分图。A图粪便；B图结肠；C图肝脏；D图血液；E图海马。其中为正常组，为万古霉素干预正常组，为环丙沙星+甲硝唑干预正常组，为糖尿病组，为糖尿病万古霉素组，为糖尿病环丙沙星+甲硝唑干预组19 温州医科大学硕士学位论文表1基于粪便样本代谢组学的OPLS-DA模型参数ModelO+PR2Q2PC&CV1+10.8900.6250.103C&CCM1+10.8860.6100.079CV&CCM1+10.9040.0091.000DM&C1+10.9880.9510.000DM&DMV1+10.9760.9330.000DM&DMCM1+10.8570.0900.957DMV&DMCM1+10.7660.3070.515其中O代表一次正交，P表示最少一个变量，R2，Q2，P分别表示模型的拟合度，预测能力以及相应的统计学，R2，Q2越高，P<0.05则视为该模型可靠，真实。C，DM分别表示正常组，糖尿病组；CV，DMV表示万古霉素干预组；CCM，DMCM表示环丙沙星+甲硝唑干预组。图6粪便样本模式识别图。A、B左边分别为正常组VS糖尿病组，糖尿病VS糖尿病万古霉素干预组大鼠粪便样本的OPLS-DA得分图，右边为相应的S-plot图，反映引起左边得分图区分较大贡献的代谢物，为正常组，为糖尿病组，为糖尿病万古霉素干预组。20 温州医科大学硕士学位论文图7粪便样本中不同组别间的代谢物浓度变化。C：正常组，DM：糖尿病组，DMV:糖尿病万古霉素干预组。*表示和对照组比#表示和糖尿病比。显著性水平：*#P<0.05；##**p<0.01；***###p<0.001。3.4.2.2抗生素对糖尿病晚期大鼠结肠样本代谢模式的影响从图5B结肠样本的OPLS-DA得分图中，我们看出正常组和糖尿病大鼠的代谢差异明显不同。根据该模型提供的R2、Q2以及相应P值（表2），我们发现正常组，糖尿病组以及糖尿病万古霉素干预组的模型可信度较高。图8为相应的得分图和S-Plot图，从图8A左边我们发现正常组和糖尿病组在PC1方向上明显区分，相应的S-plot图显示造成这种区分的关键代谢物变化主要涉及乙酸、丁酸、乳酸、葡萄糖、琥珀酸、胆碱、牛磺酸。图8B左边糖尿病组和糖尿病万古霉素干预组代谢模式存在差异，涉及到的代谢物主要包括乙酸、丙酸等，具体含量变化如图9所示。21 温州医科大学硕士学位论文表2基于结肠代谢组学的OPLS-DA模型参数ModelO+PR2Q2PC&CV1+10.687-0.0571.000C&CCM1+10.6040.2690.649CV&CCM1+10.9380.6840.096DM&C1+10.9790.9360.000DM&DMV1+10.9210.6350.027DM&DMCM1+10.8490.5340.198DMV&DMCM1+10.8090.1420.850其中O代表一次正交，P表示最少一个变量，R2，Q2，P分别表示模型的拟合度，预测能力以及相应的统计学，R2，Q2越高，P<0.05则视为该模型可靠，真实。C，DM分别表示正常组，糖尿病组；CV，DMV表示万古霉素干预组；CCM，DMCM表示环丙沙星+甲硝唑干预组。图8结肠样本模式识别图。A、B左边分别为正常组VS糖尿病组，糖尿病VS糖尿病万古霉素干预组大鼠粪便样本的OPLS-DA得分图，右边为相应的S-plot图，反映引起左边得分图区分较大贡献的代谢物，为正常组，为糖尿病组，为糖尿病万古霉素干预组。22 温州医科大学硕士学位论文图9结肠样本中三组间的代谢物浓度变化。C：正常组DM：糖尿病，DMV:糖尿病万古霉素干预组。*表示和对照组比#表示和糖尿病比。显著性水平：*#P<0.05；**##P<0.01；***###P<0.001。3.4.2.3抗生素对糖尿病晚期大鼠肝脏样本代谢模式的影响图5C展示了肝脏样本的OPLS-DA得分图，我们发现正常组和糖尿病组代谢模式差异明显。根据模型提供的R2、Q2以及相应P值（表3），我们发现正常组，糖尿病组，糖尿病万古霉素干预组的模型较为可靠。图10为相应的得分图和S-Plot图。从图10A左边我们发现正常组和糖尿病组明显区分，相应的S-plot图显示是由于乳酸、葡萄糖、胆碱、丙氨酸含量变化所致。图10B左边糖尿病组和糖尿病万古霉素干预组差异显著，涉及到的代谢物变化有葡萄糖、胆碱、3-羟基丁酸、丙氨酸、谷氨酸、甜菜碱，具体含量变化如图11所示。23 温州医科大学硕士学位论文表3基于肝脏样本代谢组学的OPLS-DA模型参数ModelO+PR2Q2PC&CV1+10.3790.1500.891C&CCM1+10.711-0.5241.000CV&CCM1+10.405-0.2381.000DM&C1+10.9860.9680.000DM&DMV1+10.8560.6110.036DM&DMCM1+10.6910.2450.695DMV&DMCM1+10.409-0.0451.000其中O代表一次正交，P表示最少一个变量，R2，Q2，P分别表示模型的拟合度，预测能力以及相应的统计学，R2，Q2越高，P<0.05则视为该模型可靠，真实。C，DM分别表示正常组，糖尿病组；CV，DMV表示万古霉素干预组；CCM，DMCM表示环丙沙星+甲硝唑干预组。图10肝脏样本模式识别图。A、B左边分别正常组VS糖尿病组，糖尿病VS糖尿病万古霉素干预组大鼠肝脏样本的OPLS-DA得分图，右边为相应的S-plot图，反映引起左边得分图区分较大贡献的代谢物，为正常组，为糖尿病组，为糖尿病万古霉素组。24 温州医科大学硕士学位论文图11肝脏样本中不同组别间的代谢物浓度变化。C：正常组DM：糖尿病，DMV:糖尿病万古霉素干预组。*表示和对照组比#表示和糖尿病比。显著性水平：*#P<0.05；**##P<0.01；***###P<0.001。3.4.2.4抗生素对糖尿病晚期大鼠血液样本代谢模式的影响图5D展示了血液样本的OPLS-DA得分图，表明正常和糖尿病组代谢模式存在差异。根据模型提供的R2、Q2以及相应P值（表3），我们得知正常组，糖尿病组，糖尿病联用组的模型较为可靠。图12为相应的得分图和S-Plot图。图12A左边得分图显示正常组和糖尿病组代谢模式改变，相应的S-plot图显示这是因为乳酸、葡萄糖、低密度脂蛋白/极低密度脂蛋白、胆碱、谷氨酰胺这些代谢物含量发生改变。图12B左边糖尿病万古霉素干预组和糖尿病联用组显著区分，涉及到的代谢物有葡萄糖、乳酸、胆碱、低密度脂蛋白/极低密度脂蛋白、3-羟基丁酸、乙酰乙酸含量变化，具体定量结果如图13。25 温州医科大学硕士学位论文表4基于血液样本代谢组学的OPLS-DA模型参数ModelO+PR2Q2PC&CV1+10.8280.5960.183C&CCM1+10.751-0.4501.000CV&CCM1+10.8330.6200.156DM&C1+10.9930.9900.000DM&DMV1+10.7270.4060.224DM&DMCM1+10.7830.4740.281DMV&DMCM1+10.8670.7380.018其中O代表一次正交，P表示最少一个变量，R2，Q2，P分别表示模型的拟合度，预测能力以及相应的统计学，R2，Q2越高，P<0.05则视为该模型可靠，真实。C，DM分别表示正常组，糖尿病组；CV，DMV表示万古霉素干预组；CCM，DMCM表示环丙沙星+甲硝唑干预组。图12血液样本模式识别图。A、B左边分别正常组VS糖尿病组，糖尿病万古霉素干预组VS糖尿病联用干预组大鼠血液样本的OPLS-DA得分图，右边为相应的S-plot图，反映引起左边散点图区分较大贡献的代谢物，为正常组，为糖尿病组，为糖尿病万古霉素干预组，为糖尿病联用干预组。26 温州医科大学硕士学位论文图13血液样本中四同组别间的代谢物浓度变化。C：正常组DM：糖尿病，DMV:糖尿病万古霉素干预组DMCM：糖尿病联用组。*表示和对照组比#表示和糖尿病比。显著性水平：*#p<0.05；**##p<0.01；***###p<0.001。3.4.2.5抗生素对糖尿病晚期大鼠海马样本代谢模式的影响图5E展示了海马样本的OPLS-DA得分图，我们发现正常组和糖尿病组代谢发生改变，根据模型提供的R2、Q2以及相应P值（表5），我们发现正常组大鼠和模型组大鼠模型较为可靠。图14为相应的得分图和S-Plot图，从图14A左边我们发现正常组和糖尿病组显著区分，相应的S-plot图显示这是由于乳酸、肌酸、胆碱、牛磺酸、谷氨酸、γ-氨基丁酸代谢物含量改变，定量图如图15所示。27 温州医科大学硕士学位论文表5基于海马样本代谢组学的OPLS-DA模型参数ModelO+PR2Q2PC&CV1+10.9290.6640.114C&CCM1+10.766-0.0911.000CV&CCM1+10.8950.4480.395DM&C1+10.9940.9800.000DM&DMV1+10.8190.0790.924DM&DMCM1+10.8340.4410.332DMV&DMCM1+10.9470.2560.621其中O代表一次正交；P表示一个变量。R2，Q2，P分别表示模型的拟合度，预测能力以及相应的统计学，R2，Q2越高，P<0.05则视为该模型可靠，真实。C，DM分别表示正常组，糖尿病组；CV，DMV表示万古霉素干预组；CCM，DMCM表示环丙沙星+甲硝唑干预组。图14海马样本在疾病状态下的模式识别图。A左边为正常组VS糖尿病组大鼠血液样本的OPLS-DA得分图，右边为相应的S-plot图，反映引起左边散点图区分较大贡献的代谢物，为正常组，为糖尿病组。28 温州医科大学硕士学位论文图15海马样本中不同组别间的代谢物浓度变化。C：正常组DM：糖尿病，DMV:糖尿病万古霉素干预组DMCM：糖尿病联用组显著性水平：*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。为了能够更为直观的看出抗生素对糖尿病大鼠各样本间代谢模式影响，根据样本1H-NMR谱图定量分析结果做了具体的代谢变化，如图16所示。从图中我们发现糖尿病大鼠，除了海马和血液中的相关代谢不受影响（图16B），其他样本中的代谢均发生紊乱，正常组中除了海马组织外，其他样本的代谢均出现变化（图16A）。图16抗生素干预后各样本间的代谢变化汇总图。图A、B分别表示正常和糖尿病大鼠给予抗生素后的代谢变化，红色箭头表示万古霉素干预；蓝色箭头表示联用干预；等号表示无显著性变化。29 温州医科大学硕士学位论文4分析与讨论目前针对糖尿病晚期患者对于抗生素合理使用的相关工作已逐渐展开。本课题应用核磁共振代谢组学技术，初步探究了抗生素对正常大鼠和STZ诱导的糖尿病晚期大鼠代谢表型的影响，具体结果如下。4.1抗生素导致糖尿病晚期大鼠学习记忆受损近年来，研究者发现利用抗生素诱导的肠道菌群组成可能可能会通过一种特殊的肠脑轴系统影响中枢神经系统中的信息传递，进而引发脑认知功能障碍[44]、阿尔兹海默症等神经系统病变[45]。Morris水迷宫行为学实验是啮齿类动物进行脑神经功能方面研究较为常用的实验方法。大量文献对已知脑区在水迷宫中的作用进行研究。例如当海马[46]、小脑[47]以及其他脑区[48]出现损伤时，水迷宫结果都表现出一定的空间学习记忆障碍，从而被广泛用于脑神经损伤模型动物空间记忆学习记忆的检测[49-51]。因此，本研究采用经典的Morris水迷宫对正常和糖尿病大鼠抗生素干预后的空间学习记忆能力进行测定。结果显示，抗生素干预正常大鼠后，大鼠的空间学习记忆能力出现损伤。有研究报道糖尿病晚期大鼠会出现认知功能障碍[52-53]。本研究也证实了糖尿病晚期大鼠会出现学习记忆障碍，除此之外，我们发现中万古霉素的使用会进一步加重学习记忆障碍。由此得出结论：万古霉素对正常和糖尿病晚期大鼠的认知功能均有损伤。Fröhlich等也发现了万古霉素对大鼠的脑认知有一定损伤[54]。4.2抗生素导致糖尿病晚期大鼠菌群代谢紊乱抗生素能够影响大鼠肠道菌群的构成。本研究结果显示，正常和糖尿病大鼠在万古霉素干预后，厚壁杆菌的数量出现了下降。Condon等利用抗革兰氏阳性菌药物万古霉素以及抗革兰氏阴性菌药物链霉素+多粘菌素联用，对糖尿病大鼠进行干预，结果发现大鼠肠道中厚壁杆菌、毛螺旋菌（Lachnospiraceae）、普雷沃氏菌丰度增加[55]。有研究指出这些细菌主要将纤维素，半纤维素等机体自身难以分解的多糖类成分进行转化，变成低聚糖和寡糖，从而满足自身的能量供应[56]，随着研究深入，有充分证据表明在一些疾病的发生发展过程中，例如神经系统疾病[57]、代谢性疾病[58]，肠道内特定的细菌改变能够破坏胰岛素的耐受性，从而增加患有糖尿病的风险。Thaiss等利用肥胖小鼠模型，通过喂养脂质含量较多的食物一段时间，随后进行正常饮食，循环3次。菌群分析显示小鼠正常饮食后，30 温州医科大学硕士学位论文肠道内产黄酮类化合物的菌群显著上升，通过该化合物的增加抑制UCP-1-a基因表达，进而加重糖尿病和肥胖[59]。基于代谢组学技术我们发现糖尿病大鼠给予万古霉素后，肠道和粪便中菌群代谢产物含量下降，尤其丁酸代谢物。丁酸是肠道菌群利用膳食纤维发酵产生的主要代谢产物。目前文献已经提出丁酸的变化和认知有着直接联系。Sharma等研究指出外源性丁酸的补充能够明显改善糖尿病和血管性痴呆大鼠的认知功能[60]。Liu等在糖尿病晚期大鼠腹腔注射丁酸盐溶液后，大鼠的认知功能也得到一定缓解[61]。海马组织中BDNF作为神经蛋白营养因子，通过改变神经元和突触结构，增加突触可塑性，进而改善脑功能的学习和记忆能力[62]。有报道指出，丁酸改善大鼠的认知功能障碍的主要原因是脑源性生长因子（BDNF）的上调。Intlekofer等研究发现中枢注射丁酸盐溶液，小鼠脑内BDNF水平显著上升，通过行为学实验发现治疗组的学习记忆明显改善[63]。Bredy等利用B6小鼠腹腔注射丁酸盐，BDNF的表达也显著上升[64]。Varela等对PD模型鼠腹腔注射丁酸溶液后发现脑内BDNF含量同样出现上升[65]。通过我们的结果猜测抗生素诱导的认知功能受损可能和丁酸代谢水平变化有关。4.3抗生素导致糖尿病晚期大鼠能量代谢紊乱本研究中，我们发现万古霉素干预后，糖尿病组大鼠粪便和肝脏中一些能量代谢产物发生变化。如粪便和结肠中的丁酸、葡萄糖水平下降，肝脏中琥珀酸水平下降等。文献报道指出短链脂肪酸含量的上升增加机体的能量代谢，尤其丁酸代谢物水平。Donohoe等对无菌小鼠接种产丁酸的厚壁杆菌或外源性注射丁酸后，小鼠的能量代谢显著上升[66]。此外，短链脂肪酸受体GPR41敲除小鼠实验同样证明短链脂肪酸能够促进机体的能量代谢[67]。通路研究发现丁酸能够增加肝脏和肌肉组织中AMP-激活蛋白激酶（AMPK）的活性，提高过氧化物酶体活性，激活过氧化物酶受体（PGC-1γ）的表达，提高机体的能量和脂肪酸代谢[68]。白色脂肪组织中，乙酸、丁酸通过抑制游离脂肪酸受体（Ffar-2/3），提高结肠组织中酪酪肽（PYY）和胰高血糖素样肽（GLP-1）的表达水平，经血液吸收进入肌肉、胰腺或脂肪组织，促进葡萄糖的吸收，提高机体能量代谢[14]。以上结果表明抗生素造成的能量代谢紊乱可能和粪便中丁酸的水平有关。至于延胡索酸含量下降，机体的能量代谢可能会受到影响，因为它是三羧酸循环的重要底物之一，是保证三羧酸循环进行，能量供能的前提。此外，也有报道成琥珀酸的变化对于能量代谢的影响，Mandardr等通过外源性注射琥珀酸溶液后能量代谢下降[69]。Gellerich等对败血性狒狒研究发现能量代谢发生紊乱的原因是由于线粒体复合物1或2活性减弱，结果发现减弱这类物质的主要原因是琥珀酸的下降，无法激31 温州医科大学硕士学位论文动该受体的表达[70]。我们研究结果也体现了琥珀酸含量下降，说明琥珀酸可能参与抗生素造成能量代谢紊乱有关。4.4抗生素导致晚期大鼠氨基酸代谢紊乱邹倩等报道支链氨基酸，尤其是亮氨酸，可作为一种反馈信号，抑制胰岛素的释放，降低机体的糖脂和氨基酸代谢，从而诱发糖尿病[71]。在本研究中我们发现万古霉素干预后，糖尿病晚期大鼠肝脏、粪便以及血液中支链氨基酸水平未发生显著性变化。该结果和我们前期抗生素干预后血糖以及后期认知障碍不同。由此我们推断万古霉素对正常和糖尿病的晚期大鼠氨基酸代谢紊乱可能不是通过支链氨基酸途径实现。谷氨酸和谷氨酰胺作为非必需氨基酸，在能量供应、激素分泌中发挥重要作用。研究报道谷氨酸、谷氨酰胺是肠粘膜活动的主要能量来源，通过肠上皮细胞的氧化作用，为人体或动物提供能量[72]。Lyoo等报道谷氨酸上升能够改善糖尿病患者的认知障碍[73]。本研究中，我们发现抗生素干预后，糖尿病晚期大鼠结肠以及肝脏中谷氨酸水平升高，粪便样本中谷氨酸水平下降。由此说明万古霉素诱导的认知障碍可能与谷氨酸水平有关。此外，谷氨酰胺作为谷氨酸合成前体，刺激β细胞产生胰岛素，从而改善糖尿病[74]。Greenfield等报道口服谷氨酰胺能够显著增加GLP-1的表达，从而缓解糖尿病病情[75]。我们发现，万古霉素干预后，糖尿病晚期大鼠的结肠组织中谷氨酰胺水平显著上升，由此说明氨基酸的紊乱可能不是通过谷氨酰胺的变化实现。苯丙氨酸水平上升能够促进胰岛素的分泌，进而改善糖尿病[76]。本研究发现在糖尿病大鼠万古霉素干预组的粪便样本中，苯丙氨酸水平下降，表明万古霉素加重糖尿病晚期大鼠病情可能与粪便中苯丙氨酸水平下降有关。Waisbren等报道苯丙氨酸含量上升能够改善认知[77]。虽然本实验中正常大鼠在万古霉素干预后，其水平上升，但是行为学实验显示其认知功能受损。说明正常大鼠在万古霉素干预后出现的认知障碍可能不是通过苯丙氨酸实现。有报道称血清中苯丙氨酸在苯丙氨酸羟化酶的作用下，转变成酪氨酸[78]。和苯丙氨酸的作用一样，酪氨酸同样能够改善糖尿病和认知[79]。但是在本实验中，糖尿病万古霉素干预组大鼠血清中酪氨酸水平却出现了上升，其原因需要进一步分析。32 温州医科大学硕士学位论文5总结根据以上结果和讨论，我们可以得出如下结论：1抗生素干预后，对正常和糖尿病晚期大鼠血糖和体重无明显变化。2万古霉素干预糖尿病晚期大鼠后，认知损伤加重，作为平行对照的正常组而言，也同样出现认知损伤。3菌群分析结果显示厚壁杆菌属（产生丁酸）数量下降，结合代谢组学结果我们推测该类菌属丰度可能会加重脑认知功能障碍，并通过丁酸的水平变化体现。4粪便和结肠中氨基酸代谢也均出现紊乱；海马中无明显变化。5抗生素干预后，糖尿病晚期大鼠肝脏样本中能量、酮体以及氨基酸代谢紊乱加剧。6抗生素干预后，糖尿病晚期大鼠血液样本中相关代谢几乎不受影响。以上研究也存在一些不足之处，需要进一步实验证明：1本研究的结果是基于核磁共振氢谱之上完成的，但是检测到的代谢物有限，尤其脑中短链脂肪酸含量变化，因此需要借助其他仪器如质谱、多功能测序仪加以佐证，完善结论。2本实验只进行了代谢组学技术初步表征分析，后续我们将从基因，蛋白水平进行研究，借此完善我们的结论。33 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温州医科大学硕士学位论文致谢时光荏苒，岁月如梭，一眨眼三年的研究生生涯即将结束。回顾这几年的时光，内心感触颇多，回忆过去，有过迷茫，有过失落，有过失败，同时也收获了很多快乐和成长。相信这些宝贵的经历会让我在以后的工作学习中受益匪浅。一想到即将离开七年的温州医科大学，内心依旧不舍，学校的人文关怀，学生间浓厚的学习氛围让我永生难忘。除此之外，三年间的快速成长，收获离不开实验室的老师们和小伙伴以及给与我帮助和支持的家人。首先要感谢我的导师高红昌教授，感谢您让我走进NMR这个大家庭，您那精益求精，严以律己的工作态度，平易近人的仪表风范深深的影响着我，三年的每次接触都让我受益匪浅，记忆犹新，再次感谢老师您的指导；其次感谢我的指导老师郑宏副教授，从选题开始到后期完成，一步一步的指导着我，每当遇到不懂的地方，您总是不厌其烦的为我讲解，也经常给我以及实验室的伙伴讲解各种软件，图表操作等，虽然您刚进来没多久，但是对于我们您是无私奉献。除此之外生活上您像大哥哥样关心着我们，无论情感，生活等方面，您总是尽其所能为我们排忧解难，对于您的关心和爱护，感激之情溢于言表，在此向您致以崇高的敬意。此外感谢给与我论文帮助的赵良才、李晨老师以及杨长伟老师，在课题实验方案、仪器指导及实验结果方面,提供了众多宝贵意见，在此表示热烈感谢。感谢已经毕业的师兄师姐们教会我实验基本操作以及数据处理，同时也教会了我很多为人处世的道理，正因为你们的帮助，我才有现在的进步，在此表示感谢。感谢我的同门们在我最无助的时候给与帮助，是你们让我感到精神上的动力和方向，我会好好珍惜。同时也感谢实验室一群可爱的师弟师妹们，你们是我实验顺利的主要力量，也正是因为你们才能让实验进度大幅提高，在此表示衷心的感谢。最后感谢我的家人对我无私的奉献和支持，对于他们的恩情，无以回报，只能努力前行。43 温州医科大学硕士学位论文综述肠道菌群与代谢疾病的研究摘要：据世卫组织最新流行病学统计，肿瘤，心血管疾病以及代谢疾病日渐成为危害人类健康的三大杀手，尤其在中等欠发达地区。截止2030年，其发病人数约占全球总人数的1/10，且呈现逐年增长的趋势。然而针对这些疾病的具体发病机制，目前还未寻找出明确的治疗手段，每年的治疗费用给社会以及家庭带来严重负担。因此预防和治疗这些疾病已然成为一项重要的全球公共卫生问题。随着医学微生物学科的发展，研究者发现人类肠道尤其结肠中含有大量的肠道细菌，借助基因组学辅助手段我们发现这些菌群与人类健康存在很大的相关性。此外，2015年《Nature》报道了肠道与大脑神经系统疾病之间的关系。强调菌群失衡是导致神经系统疾病发生的主要因素。因此本文主要总结肠道菌群相关内容及在疾病中的应用。关键词：肠道菌群;代谢疾病;代谢;肠-脑理论；抗生素随着微生物学的出现，人们在动物消化道中发现大量微生物群。特别在一些食草动物体内。后来动物学家发现这些动物主要以纤维素或半纤维素等多糖依靠自身的酶难以消化，而肠道中一些菌群例如消化菌利用发酵的方式能够将这些未消化的纤维素有多糖转变为单糖给自身供能。随着医学技术的发展，在人类的结肠部位也存在着大量微生物。据推测，这些数量是人体细胞总数的10倍大约1014个[1]。虽然有部分属于有害菌，但是绝大部分是无害的甚至有益的。这些菌属群落统称肠道菌群。它们各司其职，包括促进机体消化，为人体供能，并且通过自身屏障和提及免疫系统，阻止病原体进入体内，保护宿主避免感染，维护免疫系统平衡。随着研究的深入，肠道菌群在维持人体正常功能的作用日益受到重视，利用基因组学技术我们发现肠道菌群的稳态与认知，疼痛，并与糖尿病，肥胖等密切相关。一旦菌群失衡，则会产生一系列病，问题是肠道菌群和疾病间的作用机制直至目前还没有得到很好的解决方案。此外，不同领域之间的相互补充也需要进一步验证。1肠道菌群概述44 温州医科大学硕士学位论文肠道微生物的组成庞大，种类高达1000种之多，菌群数目大约1014。主要分为需氧菌，厌氧菌以及兼性厌氧菌三大类，而又以需氧菌和兼性厌氧菌为主要类别。随着基因组学的技术发展，人们根据不同类别的生物学功能又分为9门细菌，包括拟杆菌门（bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinomycetes）、梭杆菌门（Fusobacteria）以及变形菌门（Proteobacteria）等[2-3]。其中厚壁菌门和拟杆菌们占据绝对优势。肠道菌群和宿主以及菌群优劣势菌群之间相互制约共同维护机体健康状态，如果这种平衡被打破，宿主就有可能处于疾病状态。婴儿出生之前存在于母体子宫内几乎处于无菌环境，当出生后一段时间肠道内逐渐拥有菌群。主要来自两方面。一方面依赖于宿主基因，另一方面细菌通过分娩时阴道物质摄入，口腔摄入以及空气呼吸进入新生儿体内并在肠道内生存，形成最初的肠道菌群。目前，临床上将分娩分为顺产和剖腹产两种，两者不同不同之处在于剖腹产时，婴儿体内双歧杆菌的数量会显著下降。而这种细菌和婴儿免疫系统发育密切相关[4]。此外，相比较顺产，剖腹产婴儿摄取母乳的时间也会持久，因此与外界的环境接触时间较长。这个过程对体内的菌群变化也是有着潜在的影响[5]。随着婴儿的成长，尤其在摄入食物开始，肠道菌群的种类和结构则会朝着成人肠道群落的方向发展直至趋于稳定。最终形成较为成熟的肠道菌群，伴随我们一生。2影响菌群组成因素Hu等通过对过去菌群和机体之间的研究总结，发现菌群稳态和人体健康密切相关，一旦失衡，宿主的免疫和消化系统就会被破坏，从而引发一系列疾病[6]。目前针对菌群稳态的研究，主要集中在饮食，药物干预等方面，本文将详细讨论。2.1饮食研究指出饮食能够影响肠道菌群组成。Zhang等通过对比Apoa-I敲除和野生B6小鼠探究不同食物组成对于菌群变化的影响。敲除鼠给予高脂饲养，野生组则正常饮食，利用基因组学技术揭示两组之间的不同，结果发现敲除组内的菌群数量以及种类相比较正常组有着明显的变化，因而推测食物能够可能改变菌群组成[7]。众所周知，欧洲儿童日常饮食中含有丰富的糖、蛋白成分，而非洲儿童由于条件缺陷饮用的则是含有大量碳水化合物成分的食物。人口统计学家Filippo等利用基因组学技术分析研究非洲和欧洲儿童体内的菌群变化。结果发现两者之45 温州医科大学硕士学位论文间存在明显差异。研究发现，相比较欧洲儿童，非洲儿童体内放线菌门和拟杆菌们数目占居较大比例，并且产生了密螺旋菌门（GenusTreponema）等特有菌[8]。Salzman等指出相比较非母乳喂养的婴儿，正常母乳喂养的婴儿体内含有较多含量的乳酸杆菌（Lactobacilli）[9]。Turnbaugh等通过高脂食物探究不同组别之间的菌群变化，对同类别的小鼠给予高脂和正常食物2周，结果发现小鼠肠道中菌群组成随着食物的不同发生相应改变。相比较正常饲养的小鼠，高脂组小鼠体内菌群数量增加。而厚壁杆菌门以及拟杆菌门数目在OTU水平上明显下降[10]。有报道指出厚壁杆菌在人体肠道中主要水解碳水化合物以及蛋白质类分子，拟杆菌门促进机体糖脂以及胆汁酸代谢[11]。结合这两种细菌的生物学功能，不难证实高脂饲养组小鼠在体重等表征指标上具有明显差异。Xu等具有肠屏障保护功能的双歧杆菌门也因为高脂食物的摄入也发生巨大变化，结果证实高脂组小鼠肠道的通透性发生改变，炎性因子显著增加，相比较正常饮食组小鼠[12]。Murphy等通过对野生型小鼠喂以常规食物，对肥胖小鼠给与低脂肪食物饲养8周观察菌群变化，结果发现厚壁菌门以及拟杆菌门数目显著变化，相比较对照组而言[13]。Hildebrandt等将RELMβ基因敲除小鼠和野生鼠分别从常规饲料转变到高脂后，两大优势菌尤其拟杆菌门大幅减少，推测这种变化是由食物类型转变造成[14]。由此可见对肥胖来说，并非简单地通过遗传或肥胖基因能够解释其病因，长期摄入高脂饮食会导致肠道菌群稳态发生紊乱，尤其拟杆菌门这种对糖脂合成有着密切关系的菌群变化，从而导致肥胖的发生。2.2抗生素Ubeda等对耐万古霉素肠球菌的小鼠进行抗生素干预后，造成肠道大面积感染，揭示抗生素的使用在治疗范围外产生一定的副作用，破坏机体的菌群稳态[15]。此外，临床上应用范围较广的抗生素环丙沙星也会出现这种情况。Dethlefsen等利用16SRNA测序技术证实服用服用环丙沙星后，其患者体内菌群种类以及数量均遭到破坏，有意思的是在治疗4周后停药，体内大多数菌群恢复到治疗状态，但也有例外的菌门则未恢复到健康水平[16]。Jernberg等对拟杆菌感染的患者服用氯洁霉素一周后，在接下来的两年时间定期随访，对比发现除了几种特殊的菌群外大部分都已经恢复至常态[17]。随着中药在国际上的影响力与日俱增，很多功效例如预防保健，抗菌，抗肿瘤等逐渐被认可。利用前面已知的实验结果，Zhang等利用高脂饲养的小鼠给予黄连素干预，借助测序平台结果分析我们发现喂有黄连素组的小鼠体内菌群丰富度明显下降，具体表现为有益菌的增加和有害46 温州医科大学硕士学位论文菌的抑制[18]。以上结论由此看出抗生素对于机体恢复状态也存在不可逆的现象发生。这大概可以解释为何一些抗生素对于疾病不但没有治疗反而有加重的情况发生。也有人持相反意见，Jansson等报道指出某些特异性菌群变化并不会造成真正的健康问题，因为人的生陈代谢是交替性的，尽管某种或某几种菌群消失，但是会有相同或相似功能的菌群代替，用以维持其生理稳态[19]。2.3年龄前言提及，婴儿和成人时期菌群不同。分娩前，婴儿肠道几乎是无菌的，从分娩方式以及外界环境中的细菌进入婴儿肠道并定居于此，由此也造成了不同个体之间菌群差异[20-21]。类似于人体生长速度，婴儿时期的肠道菌群会一直处于生长阶段直至趋于稳定，但相比较成人来说OTU值还是显著较低的，主要集中在大肠杆菌，志贺氏菌门。成年人肠道无论从种类还是数量远远高于婴儿期，毋庸置疑，除了厚壁杆菌等两种具有重要生理学功能优势菌外[22]，放线菌以及变形菌门同样占有较大比例且存在严重的个体差异。并且这些菌群比例在未来的十几年间保持一个相对稳定的波动变化[23]。Jelena等证明中年人肠道中嗜酸乳（Lactobacillus-acidophilus），瑞士乳杆菌（L.helveticus）含量较为丰富。老年人肠道中则含有较多的梭杆菌门包括罗伊氏乳杆菌（L.reuteri），植物乳杆菌（L.plantarum）[24]。Drago等利用基因组学技术发现老年人肠道中优势菌门数量显著下降而梭菌门的含量随之上升，而这一现象和之前所述一致因此学者根据该现象将其视为老年阶段特征性菌群[25]。2.4遗传因素研究指出，宿主遗传基因对于维持肠道菌群稳态同样发挥重要作用。Yatsunenk等将自闭症儿童、具有血缘关系的健康儿童、无血缘关系的健康儿童比较，结果显示自闭症患儿肠道内的溶组织梭菌数量远远高于其他两组健康儿童，此外，具有血缘关系的健康儿童其溶组织梭菌数量也高于非血缘健康儿童。此发现可以推断血缘相近人群其体内菌群结构，种类以及变化大致相似，并且具有遗传性[26]。Zoetenda等对同卵双胞胎的肠道菌群研究发现其菌群结构以及种类变化相比较在同环境下生存例如夫妻或群居生活而言具有较高的相似性[27]。此外，Stewart等利用异卵双胞胎研究一方面验证了遗传的相似性，此外从另一方面异卵双胞胎出发得出同卵双胞胎的结构相似性也高于异卵双胞胎[28]。不仅细胞层面证实有遗传效应，动物实验也被同样证实。我们从动物层面也证实遗传基因型影响菌群多样性。Ley等发现瘦素基因发生突变后，其相应的小鼠则会往肥胖47 温州医科大学硕士学位论文的方向发展，并且优势菌群数量也发生相应变化[29]。Benson等利用基因组学技术从两组基因型相差较大的小鼠肠道菌群进行归类分析，结果证实和大多数正常小鼠菌群类别大致相同[30]。Hildebrand等将宿主基因型，环境等条件作为探究大鼠肠道菌群的基本实验，结果发现不同品系的大鼠之间菌群组成差异明显，且具有亲门或直系血缘关系之间的菌群组成具有较高的相似性，此外，即使处于不同的生活环境，具有血缘关系的个体之间菌群构成同样具有较高的相似性[31]。以上实验充分说明了基因遗传性和肠道构成之间的关系。3肠道菌群和代谢疾病3.1肠道菌群和帕金森疾病PD在全世界范围内影响着1000万人。其症状主要包括手脚震颤、不自主抖动，动作迟缓，大脑黑质中多巴胺能神经元的缺失，大脑和肠内的细胞出现α-突触核蛋白的蛋白的聚集，脑内炎症分子增多等等。75%的PD患者都出现胃肠道功能异常，其中最主要是便秘[32]。人类肠道中的微生物对免疫和神经系统的发育及功能都起着重要作用[33]。70%的周围神经系统都存在于肠道中，肠道神经系统通过迷走神经与中枢神经系统直接相连。由于胃肠道问题通常在运动症状出现之前就已经发生了，并且大多是PD病例是由环境因素引起的，因此，研究人员推断肠道微生物可能是导致PD的罪魁祸首之一[34]。过表达α-Syn的无菌小鼠也表现出与PD小鼠相似的的行为学特征[35]。为了进一步研究两者之间的关系，研究人员利用过表达α-Syn并表现出帕金森症状的无菌鼠（在完全无菌的环境中繁殖，因此缺乏肠道细菌），测试两组小鼠的运动技能，有意思的是无菌鼠的行为学实验好于常规鼠，由于两者体内α-Syn过度表达，由此排除这一影响因素，两者最大的不同则是菌群的有无，利用菌群移植技术在无菌鼠上移植正常鼠细菌，和预期想的一样，小鼠的正常运动技能正常，即使α-Syn过量表达。同时，帕金森病的典型症状也在无菌小鼠中都消失了，因此研究人员确定，肠道菌群在帕金森病症状中扮演着重要角色[36]。3.2肠道菌群和阿尔兹海默症（AD）AD是一种发生于老年时期的神经系统退行性疾病，其临床表现记忆受损和认知障碍。两大病理学特征包括细胞外老年斑和细胞内神经纤维缠结[37]以及TAU蛋白病变[38]。动物实验表明AD小鼠中枢神经系统发生紊乱色[39]、5-HT[40]、神经营养因子[41]等表达下降外，其肠道菌群稳态也受到破坏[42]。Shen等利用HE48 温州医科大学硕士学位论文染色发现AD模型鼠肠道内绒毛数量、厚度以及腺管长度等均明显低于野生型小鼠[43]。Harach等发现无菌鼠脑内Aβ淀粉样蛋白块显著低于正常鼠，有趣的是菌群移植后其水平得到恢复，与此同时，移植AD菌群的无菌鼠脑内Aβ数量相比较移植正常鼠明显升高。脑内海马以及皮层组织中BDNF含量降低[44]。这充分揭示了肠道微生物和AD的病发有着密不可分的联系，临床试验发现给与AD患者服用双歧杆菌、乳杆菌等优势菌后其认知能力得到提高，这背后机制可能在于外用菌产生较多的抗炎因子[45]。AD患者最常见的表现则是认知功能的受损，有研究表明肠道和脑方面也有一定联系[46]，其针对的是短链脂肪酸和大脑之间的联系[47]。其实可以从胎儿时期研究。研究报道肠道菌群和大脑之间的联系可以从胎儿出生后开始，外界环境中的微生物定居在肠道中并对大脑的发育起到关键作用，这一理论依据便是著名的“肠—脑轴”学说[48]。顾名思义，连接大脑与肠道之间交流的桥梁。过去几十年人民对于肠脑轴的认识仅停留在心情与胃肠道功能方面，对于大脑的其他生理学功能还未有深刻报道。16SRNA等技术证明了菌群的好坏影响我们的生理活动，脑部发育和认识等功能，具体从血清素、细胞因子以及代谢产物三方面进行阐述其通讯机制[49]。血清素：肠道里的细胞产生大量神经递质血清素，它们能影响大脑的信号传导[50]；细胞因子：肠道微生物能够促进免疫细胞分泌能影响神经生理学的细胞因子[51]；代谢产物：微生物产生丁酸等能改变血脑屏障中细胞活性的代谢产物[52]。3.3肠道菌群和肥胖肠道和肥胖之间的关系早在30年前就已经被人所知，利用心脏搭桥（减重）或者下丘脑腹内侧核（增重）外科手术，会相应观察到肠道微生物发生改变。利用细胞培养、原位杂交、16S测序以及实时荧光PCR等技术揭示了这些菌群主要归门三类；G-拟杆菌门，G+放线以及厚壁菌门。除了菌群稳态变化外，饮食等也会影响其变化。例如leptin缺陷的ob/ob肥胖小鼠含有较高的厚壁菌门，低于一半的拟杆菌门相比较野生型而言当给与相同饮食时[53]，此外相比较低脂低糖喂养，高脂高糖喂养的小鼠在造成肥胖的进展中肠道内厚壁菌门含量较高，这和之前研究结果一致[54]。肥胖小鼠肠道内促进能量吸收的蛋白包括唐肝水解酶、磷酸转移酶、β-转化酶以及其他的转运蛋白和发酵酶的表达量上升，这些指标表明肥胖小鼠菌群增加能量的转化率。此外临床试验我们也发现了相同的结论。相比较瘦人，肥胖人群体内厚壁菌门/拟杆菌门的比例显著增加。这和之前动物实验结果一致[55]，49 温州医科大学硕士学位论文上述结果证实了肥胖和肠道菌群确实存在某种联系，但是具体的联系还未能解开，理由是有研究者解释临床试验不同于基础实验，具有很多不可控因素例如两类食物组成不同等。Kalliomäki等从婴儿到肥胖时期肠内菌群变化，结果发现相比较瘦的儿童，有肥胖趋势的儿童体内金黄色葡萄球菌含量较高、双歧杆菌较低[56]。尽管由此发现还是还没有揭示两者之间关系。Hildebrand等利用RELMβKO小鼠（抵抗肥胖）和野生型小鼠从常规饮食转变成高脂后，发现两组肠内菌群组成变化相似[57]。利用无菌鼠以及菌群移植等手段也证实肥胖者体内菌群紊乱[58]。菌群移植被认为用来研究肥胖和肠道菌群之间最有效的手段。利用口服，腹腔注射或者共养的方式可实现菌群移植。DucaFA等将肥胖小鼠的细菌移植到无菌鼠体内发现体重以及胰岛素抵抗性增加，此外脂肪组织中的巨噬细胞渗透性也相应增加[59]。但是有研究者发现圈养的小鼠无论品种是否相同，其肠道菌群的组成都不会出现较大变化，因此用这种样式研究两者之间的联系至今没有统一的答案[60]。机制研究证实包括脂多糖（LPS）、血管生成素样蛋白4（Angptl4）以及胆汁酸和短链脂肪酸（SCFA）在其中发挥调节作用。LPS：G阴性菌产生，Cani等首次报道与肥胖有关，连续4周给与LPS后，小鼠体重增加、脂肪组织炎性以及胰岛素抵抗，而这一现象与高脂饮食症状一致，更为重要的是高脂饮食后LPS水平也显著上升。菌群移植后改善现象[61]。此后干预高脂饮食[62]、ob/ob小鼠[63]以及无菌鼠[64]等均得到一致的结论。Angptl4和胆汁酸：血管生成素样蛋白4最初由Bäckhd报道存在于脂肪组织[65]。生理功能是抑制脂蛋白酶活性调节脂质代谢[66]。但是至今对于其如何抑制仍未解决，有报道称主要是胰酶后减少脂肪的聚集[67]。此报道也未被证实，因而为了进一步研究其作用机制，有学者报道干预肠道特异性Angptl4基因敲除实验方可确定；研究指出菌群受损的同时能够激激活法尼醇X受体（FXR）[68]和G蛋白偶联胆汁酸受体1（TGR5）[69]，而这两种蛋白是胆汁酸代谢重要的调节因子。当该两种蛋白被激活，胆汁酸可以影响能量代谢、脂质合成炎症等生物学过程[70]。此外，干预无菌鼠和野生型FXR基因敲除实验同样证实胆汁酸的重要作用[71]。短链脂肪酸：短链脂肪酸更多的来源于实验，leptin敲除小鼠相比较野生型小鼠能够产生更多的SCFA[72]，实验证明加入含有短链脂肪酸的食物能够降低体重、减少脂肪的聚集以及脂肪肝变性[73]。一般认为短链脂肪酸发挥的作用与Gpr41/43受体有直接关系。例如43敲除后即使正常饮食也会造成肥胖，而当这种受体过度表达时，即使高脂饮食也不会形成肥胖。由于上述受体仅在脂肪组织中表达，因此有关食物发酵等一系列生理活动就受到这两种受体控制。以上现象说明SCFA食物—菌群—肥胖中发挥一定作用，虽然机制尚不明确。50 温州医科大学硕士学位论文3.4肠道菌群和糖尿病糖尿病是机体慢性代谢性疾病最为典型的疾病，主要是胰岛细胞破坏或胰岛素的敏感性下降导致。几年来。有关肠道菌群和糖尿病之间的研究正在相应开展。研究报道，相比较野生鼠，无菌鼠更易患糖尿病且病情加重。文献称菌群紊乱能够破坏肠粘膜屏障系统，使肠粘膜免疫丧失功能引发糖尿病。具体机制是利用BBDP鼠触发糖尿病模型后，利用有益菌或抗生素干扰后，炎症因子IFN-γ、i-NOS水平下降，抗炎因子IL-10以及紧密连接蛋白水平上升，这表明菌群对抗糖尿病发可能通过调节粘膜免疫力、维持炎症/抗炎平衡，恢复肠粘膜屏障作用[74]。Wen等敲除MyD88（TLR信号通路中关键调节分子）基因小鼠发现自身免疫升高，IFN-γ（触发糖尿病）相关反应降低，从而抵御糖尿病的发生[75]。此外致糖尿病的T细胞受体BDC2.5未能在MyD88敲除小鼠中激活，而脾脏以及肠系膜淋巴结中该受体不受影响，说明MyD88的抗糖尿病的部位具有特异性生，针对这一现象他们发现敲除小鼠体内厚壁杆菌/拟杆菌比例下降，乳酸杆菌、Porphyromonadaeae等上升，这一现象和以往针对糖尿病菌群研究结果相一致，因此研究者提出肠道菌群通过MyD88信号通路致病并涉及相关优势菌的比例变化生[76]。以上所描述的是有关T1D的相关研究。针对T2D的研究主要集中在中国,利用高通量测序T2D患者粪便样本，结果发现产丁酸的罗氏菌门和F.prausnitzii显著下降，大部分门于致病菌如大肠杆菌、埃希氏菌门、梭菌门[77]等。利用鸟枪发测序女性T2D患者绝经后的菌群分析，发现包括链球菌门、梭菌门等四类乳酸菌数目增加，产丁酸的菌群和上述研究结果一致[78]。有趣的是，将糖尿病患者与糖耐量受损患者分析比较发现能量代谢和脂肪酸代谢增加，并且免疫系统遭到破坏。以上研究清楚表明T2D的菌群变化特征，说明胃肠道可能是T2D炎症开始的部位。除了炎症反应之外，临床数据表明约20%孕妇患有糖尿病风险，主导因素就是孕妇菌群稳态遭到破坏。Koren等研究无菌孕鼠妊娠初期和晚期的菌群和代谢变化。结果发现血清leptin、胆固醇及胰岛素水平显著上升，菌群分析显示初期含有较高的厚壁杆菌（产丁酸），晚期时，小鼠肠道内的肠杆菌、链球菌增加，此外，炎症因子水平也显著升高，表明肠粘膜炎症出发很大一部分由于菌群变化所致[79]。为了验证这一结论，作者分别将初期和晚期的菌群移植到无菌鼠体内，2周后包括脂质运载蛋白等炎症因子水平明显升高相比较初期移植鼠。虽然以上结果无论从动物实验还是临床数据都证实肠道菌群的紊乱确实和疾病的发生存在必然的联系。然而由于技术等缺陷，至今我们对具体到哪一个菌群起主要疾病的结果仍未解答，只有少部分科研者找出Akkermansiamuciniphila和christensenellaceae分别是代谢途径以及肥胖的主要致病菌[80-81]。目前人们的关注51 温州医科大学硕士学位论文点集中在婴儿时期，利用不同的分娩方式以及后期的抗生素干预探究肠道菌群的“代谢行为变化”被认为有着较大的科研价值，如果未来几年该项技术成熟，那么寻找出菌群对疾病具体的致病因素将深刻影响临床治疗，并大大提高我们的治愈率。上述理论详细说明了肠道菌群和机体复杂性代谢疾病的研究进展，充分展示了肠道作为一个庞大系统是如何应对机体反应。随着肠脑轴，肠肝轴理论的丰富，能够帮助我们更好地理解人体相关代谢性疾病的发病机理，为后续药物的研究提供较好思路，进而更好地服务于临床患者。52 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