中华鲟主要组织相容性复合物II(MHC Ⅱ)cDNA克隆及功能研究

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1、温州大学硕士学位论文中华鲟主要组织相容性复合物II(MHCII)cDNA克隆及功能研究作者姓名李修玉学科专业化学生物学研究方向活性大分子导师/职称廖志勇/教授完成日期2018年5月温州大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得温州大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并

2、表示了谢意。论文作者签名：日期：年月日温州大学学位论文使用授权声明本人完全了解温州大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权温州大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本人在导师指导下完成的论文成果，知识产权归属温州大学。保密论文在解密后遵守此规定。论文作者签名：导师签名：日期：年月日日期：年月日中华鲟主要组织相容性复合物II（MHCII）c

3、DNA克隆及功能研究摘要中华鲟（Acipensersinensis）是一种古老而又珍贵的软骨硬鳞鱼类，因其对生物进化过程有着极为重要的研究意义，被称为“水中活化石”。目前中华鲟的研究主要集中在人工养殖方面，而中华鲟免疫学方面的研究较少。主要组织相容性复合物II（majorhistocompatibilitycomplexII，MHCII）类分子通过向CD4+T淋巴细胞提呈抗原性多肽，从而在适应性免疫应答中发挥重要作用。MHCII是由α和β两种亚基组装成的异源二聚体，在Iichain（MHCII-associ

4、ationinvariantchain，又称MHCIIγ）的协助下，进行正确组装和高效的转运。本文以中华鲟为研究材料，围绕中华鲟MHCII基因的cDNA克隆和免疫活性功能开展以下研究：1.提取中华鲟脾脏总RNA，通过RT-PCR构建cDNA文库，高通量测序筛选得到CsMHCIIα，CsMHCIIβ和CsMHCIIγ的cDNA序列。结果分析，CsMHCIIα，CsMHCIIβ和CsMHCIIγcDNA序列分别包含726bp、798bp和879bp的开放阅读框。氨基酸序列对比结果发现，CsMHCIIα/β几乎包

5、含已知其他物种MHCIIα/β序列的全部结构特征：一个前导肽、α1/α2和β1/β2结构域、CP/TM/CYT区域和保守的半胱氨酸残基。与其他鱼类MHCIIα相似的是，在3638CsMHCIIα中与的α1结构域包括一个潜在的糖基化位点（NGT），但其他鱼类的糖基化位点通常在α2结构域。哺乳类和两栖类的MHCIIα通常包含两个潜在的糖基化位点。CsMHCIIγ包含一个Ig-MHC样区、II类相关Ii链肽（CLIP）、甲状腺球蛋白I型重复区和三个保152154守的二硫键，同时还具有两个潜在的糖基化位点（NET和

6、167169NSS）。2.利用qRT-PCR检测CsMHCIIα，β，γ在中华鲟组织中的表达。结果显示，CsMHCIIα和β链在脾脏中表达量最高，而CsMHCIIγI链在头肾中表达量最高。利用poly（I:C）或灭活三联鳗弧菌疫苗刺激中华鲟MHCIIα和β的mRNAs的表达会上调，并且它们的转录水平在整体上poly（I:C）刺激的比细菌疫苗诱导上调地更快。然而，在脾脏和肠中利用poly（I:C）刺激后CsMHCIIγ的表达水平比细菌疫苗诱导后的更高，而在头肾和肝脏中则低于细菌疫苗诱导。3.构建pCMV-Hi

7、s-CsMHCIIα，pCMV-HA-CsMHCIIβ、29pCMV-Flag-CsMHCIIγ以及pCMV-Flag-mutCsMHCIIγ（Ser/342934Ser→Ala/Ala）表达质粒，当在小鼠树突细胞中共表达CsMHCIIα，β，γ时，CsMHCIIγ链分别与CsMHCIIα和β链存在相互作用。此外，在小鼠树突状细胞中过表达的CsMHCIIγ链显著激活NF-κB和STAT3转录因子，并诱导TNF-α和IL-6的表达。当CsMHCIIγ29342934中Ser/Ser突变为Ala/Ala，CsM

8、HCIIγ的上述活性几乎消失了。本课题研究揭示中华鲟MHCⅡα，β，γ链在中华鲟病原微生物感染的免疫应答中发挥重要作用，且有可能通过在脊椎动物进化过程中保守的功能机制发挥作用。本研究将有助于了解中华鲟的免疫生物学，为中华鲟繁殖和保护过程中的疾病防治提供理论和实验指导。关键词：中华鲟，主要组织相容性复合物（MHC）II，MHCII恒定链，免疫应答，NF-κB，STAT3IICLONINGANDFUNCTIONOFT