眼表重建手术后早期供体干细胞的存活状态及其影响因素研究

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1、摘要目的体外培养的异体角膜缘上皮细胞移植术是治疗角膜缘干细胞缺乏的有效方案，在临床中我们观察到术后有些患者会发生再次角膜新生血管化和角膜上皮反复缺损，考虑其原因可能为手术后供体细胞不能很好的存活并发挥功能。因此，本研究的目的是通过动物模型模拟该手术及术后的临床过程，探讨手术后供体细胞的存活状态和其可能的影响因素，并进一步探讨手术后可维持眼表稳定的可行措施。方法1、动物模型的建立和评价采用4周龄雌性新西兰大白兔45只，建立碱烧伤致兔眼角膜缘干细胞缺乏的动物模型。将实验兔随机分为2组：中度组和重度组，每组22只，每只兔均选右眼建模

2、、手术。用内径12mm，外径18ram的环形滤纸片浸透lmol／LNaOH，覆盖于实验兔角膜缘处，重度组接触1min，中度组接触30s。然后用0．9％氯化钠注射液冲洗角膜表面和结膜囊5分钟。烧伤后每天观察兔角膜变化，并于碱烧伤后稳定期对角膜新生血管程度和炎症程度进行评分。用HE染色方法观察比较『F常兔角膜和碱烧伤后稳定期兔角膜的组织病理学差异；用免疫组织化学方法检测正常组和碱烧伤后稳定期时兔角膜中p63、CD68的表达情况；用Realtime—PCR方法检测正常组和碱烧伤后稳定期时兔角膜中干细胞相关因子ANp630t、ABCG

3、2、CK3，及炎症因子IL．1B、IL．6、IL一4、IL—10、IL一13、TNF．0t、MCP一1、iNOS、TGF一13、VEGF的表达量。2、以羊膜为载体人角膜缘上皮细胞体外培养角膜来自山东省眼科研究所眼库，取用角膜移植后剩余的角巩膜环，将角膜上皮细胞消化成单细胞后接种于去上皮羊膜上，每天观察细胞生长情况，待细胞铺满羊膜形成复层时进行移植手术。3、以羊膜为载体培养的人角膜缘上皮细胞移植术取碱烧伤后处于稳定期的兔角膜进行手术。术中剪开全周球结膜，剥除角膜表面覆盖的血管膜，将培养有人角膜缘上皮细胞的羊膜覆盖于角膜表面，将羊

4、膜于角膜缘处缝合5～8针固定于球结膜和巩膜之问。手术中注意保护细胞避免受到损伤，术毕行睑裂缝合避免角膜过度暴露。4、手术后的临床疗效评价和供体细胞的存活状态检测分别于术后即刻，术后1天、3天、7天、14天、21天和28天时用裂隙灯显微镜观察术后兔角膜变化，对角膜新生血管化程度和炎症程度进行评分，并利用裂隙灯照相系统进行图像记录。在上述各时问点取兔角膜进行HE染色，并用免疫组化方法检测供体和受体中p63、Ki一67的表达情况。用RT-PCR方法检测术前及术后各时间点供体和受体细胞中干细胞相关因子ANp63a、Ki一67、ABCG

5、2、C／EBPA、CK3的表达量。5、手术后眼表微环境中炎症因子表达情况检测分别于手术后即刻、术后1天、3天、7天、14天、28天时取兔角膜，用免疫组化方法检测CD68的表达情况，用Realtime—PCR方法检测炎症因子IL．1B、IL一6、IL．4、IL．10、IL．13、TNF．O【、MCP．1、iNOS、TGF．B、VEGF、CD4、CD8的表达旦里O结果1、碱烧伤后兔角膜的病变特征碱烧伤后烧伤部位的角膜即呈瓷白色混浊，碱烧伤后1周内为急性期，球结膜缺血，角膜水肿，角膜上皮持续缺损，碱烧伤后第2～3周进入损伤和修复共存

6、期。中度碱烧伤组在烧伤后4～8周时角膜新生血管化，炎症反应趋于稳定；重度碱烧伤组在伤后8～12周时才能进入稳定期。中度碱烧伤组有3眼评分未达标而排除研究，重度碱烧伤组3眼角膜穿孔排除研究。根据评分标准，中度组和重度组的总分平均值分别为5．74-1．2分和8．8±1．1分，两组差别有统计学意义(仁O．000)。HE染色可见碱烧伤后稳定期时角膜表面覆盖扁平的鳞状上皮细胞，基质内见大量管径粗大的新生血管，可达深基质层。免疫组织化学检测可见大量CD68阳性的炎症细胞浸润，角膜中p63表达阴性。Realtime—PCR结果显示碱烧伤组A

7、Np630t、ABCG2、CK3的表达显著低于『F常对照组，其中重度碱烧伤组降低较中度碱烧伤组降低更为显著(P

8、片状缺损，自术后14天时可见新生血管再次长入角膜，甚至比术前更为严重。HE染色可见术后7天内羊膜与角膜贴附不紧密，术后14天时羊膜吸收，但此时角膜上皮细胞与角膜基质仍有分离现象。中度碱烧伤组术后21天和28天时角膜上皮完整，角膜基质内未见新生血管管腔：重度碱烧伤组可见角膜上皮