RANKL通过增强破骨细胞前体中不依赖TRAF6的TNF诱导的TRAF3降解促进破骨细胞生成

《RANKL通过增强破骨细胞前体中不依赖TRAF6的TNF诱导的TRAF3降解促进破骨细胞生成》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、单位代码10475学号104753140966分类号R73硕士学位论文RANKL通过增强破骨细胞前体中不依赖TRAF6的TNF诱导的TRAF3降解促进破骨细胞生成学科、专业：临床医学、肿瘤学研究方向：肿瘤免疫调节与疾病申请学位类别：医学硕士申请人：雷威指导教师：赵志军教授姚振强副教授二〇一七年六月RANKLCytokineEnhancesTNF-inducedOsteoclastogenesisIndependentlyofTNFReceptorAssociatedFactor(TRAF)6by

2、DegradingTRAF3inOsteoclastPrecursorsADissertationSubmittedtotheGraduateSchoolofHenanUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofMedicineByWeiLeiSupervisor:Prof.ZhijunZhaoAdjunctProf.ZhenqiangYaoJune,2017摘要背景正常骨骼的骨形成与骨吸收相互偶联，保

3、持动态平衡。骨重建失衡，即骨吸收增强和/或骨形成减少，就会引起骨量丢失，这见于多种成年人常见骨骼疾病，如骨质疏松、类风湿性关节炎、关节无菌性松动症、骨转移癌和牙周炎等。破骨细胞分化与功能增强是导致这些疾病骨质破坏的关键。至今还没有一种单一的药物在抑制骨吸收的同时促进骨生成。抗骨吸收或者促骨合成的药物，尤其是具有抗吸收和促合成双重作用的药物，对骨质疏松症的防治具有远大前景。大量研究证实，包括核因子κB受体活化因子配体(receptoractivatorofnuclearfactor-κBligan

4、d,RANKL)及肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor,TNF)在内的一些细胞因子可以诱导绝经后骨质疏松症及炎性关节炎患者的骨量流失。在用可与其受体相互作用的TNF受体相关因子（TNFreceptor-associatedfactor,TRAF）配体蛋白预处理后，RANKL和TNF可以在体外独立诱导野生型（wildtype，WT）小鼠破骨细胞前体向破骨细胞的分化。在这些配体蛋白中，只有TNF受体相关因子6（TNFreseptor-associatedfactor6,TRAF6）在

5、RANKL诱导的体外破骨细胞生成中是必需的，但是其分子机制并不完全清楚。目的本课题将进一步深入研究TRAF6及TRAF3在TNF和RANKL诱导的破骨细胞（osteoclast，OC）形成和激活中的作用，探索TRAF6是否参与TRAF3的降解过程及其作用机制。方法（1）我们采用TRAF6+/-小鼠与129小鼠杂交后所产的TRAF6-/-小鼠作为实验动物。观察TRAF6-/-小鼠和同窝WT小鼠次级骨化中心及干骺端破骨细胞数量。（2）收集9-16天大的TRAF6-/-小鼠和同窝野生型小鼠脾细胞在体外

6、进行细胞培养，培养过程中加入RANKL、TNF或RANKL+TNF，加或不加不同的抑制因子。培养2-4天后在倒置显微镜下观察破骨细胞的数量、面积及骨吸I收陷窝面积。将培养的成熟的破骨细胞固定后用DAPI复染，在荧光显微镜下观察肌动蛋白环。（3）收集9-16天大的TRAF6-/-小鼠和同窝野生型小鼠脾细胞在体外进行细胞培养，培养过程中加入RANKL、TNF、RANKL+TNF、TNF+TGFβ1（转化生长因子β）或RANKL+TGFβ1后，分为氯喹组及PBS对照组，观察破骨细胞的数量及面积；并采用

7、WesternBlot检测TRAF6-/-和WT破骨细胞前体在不同因子刺激下的TRAF3水平；用ELISA检测各组细胞培养基中的TNF及TGFβ1水平；用ELISA检测TRAF6-/-和WT小鼠骨裂解液中TNF及TGFβ1水平。为了探索TRAF3是否是TRAF6-/-小鼠中TNF诱导OCs生成过程中的重要抑制剂，我们采用LyMcre-TRAF3f/f与WTOCPs进行体外培养，培养过程中加入上述不同的刺激因子，观察形成的破骨细胞数量及面积。此外，我们用GFP或TRAF3逆转录病毒感染TRAF6-

8、/-和WTOCPs后，加入上述不同的刺激因子进行细胞培养，观察形成的破骨细胞数量及面积。（4）所有实验均要重复3次，结果均用x±S表示。两组比较用非配对t-检验，3组或3组以上的比较用单因素方差分析和DunnettPost-Hoc多重比较。p<0.05作为具有统计学差异的标准。结果（1）TRAF6-/-小鼠胫骨表面可见TRAP+多核OC，其数量为WT小鼠的1/4;在塑料平板上，RANKL不能诱导TRAF6-/-OCP向OC的分化，TNF可以诱导来自TRAF6-/-OCP的OC形成，其数量与同窝W