东北七鳃鳗Toll样受体信号通路基因表达研究

《东北七鳃鳗Toll样受体信号通路基因表达研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、上海海洋大学硕士学位论文学校代码：10264研究生学号：M150104139上海海洋大学硕士学位论文东北七鳃鳗Toll样受体信号通路基因题目：表达研究GenesExpressionAnalysisofToll-LikeReceptor英文题目：SignalingPathwayinNortheastChineselamprey(Lethenteronmorii)专业：临床兽医学研究方向：分子免疫学姓名：丁少青指导导师：张庆华副教授二O一八年五月二十九日上海海洋大学硕士学位论文上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指

2、导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本版权书。本学位

3、论文属于不保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日上海海洋大学硕士学位论文上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注中国水产科学研究院长江水产曾令兵研究员主席研究所杜昌升同济大学教授委员孙建和上海交通大学教授委员严亚贤上海交通大学教授委员颜标复旦大学附属眼耳鼻喉科医院研究元委员季策上海海洋大学博士生秘书水产与生命学院D101病原库会答辩地点答辩日期2018.5.29议室上海海洋大学硕士学位论文东北七鳃鳗Toll样受体信号通路基因表达研究摘要七鳃鳗是一种古老的无颌类动物，在进化上处于无脊椎动物和脊椎动物之间，对免疫系统的研究在理论上有着重要

4、的进化意义。Toll样受体是非特异性模式识别受体（pattern-recognitionreceptors，PRRs），能够识别病原体，是启动先天免疫的关键。本研究克隆获得东北七鳃鳗（Lethenteronmorii）TLR7a、TLR7b、TLR14d和TLR2d基因，利用实时荧光定量PCR分析4个TLR基因在幼鱼和成鱼中各组织的表达情况以及在铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）刺激后不同组织在不同时间点的表达量变化。构建真核表达载体并检测TLR14d和TLR2d在HEK293T细胞中的定位。为深入探索TLR基因的功能及其信号转导过程，本研究也进行TLR通

5、路相关接头分子（MyD88和TRAF6）以及下游转录因子NF-ƘB家族成员及其启动子的研究，现取得以下结果：1.东北七鳃鳗TLR基因克隆及生物信息学分析：采用克隆技术获得4个TLR基因的cDNA序列，TLR7a、TLR7b、TLR14d和TLR2d的开放阅读框（ORF）分别为3252bp、3117bp、2241bp和2439bp；编码1083、1038、746和812个氨基酸。除了TLR14d缺少LRR结构域，另外的3个TLR均具有LRR结构、跨膜区和TIR结构。系统进化树分析显示，TLR7a、TLR7b分别与哺乳类以及鱼类的TLR7聚为一支；TLR14d、TLR2d分别与哺乳类

6、、鸟类、两栖类以及硬骨鱼类的TLR2亚家族聚为一支，其中TLR14d与红鳍东方鲀（Takifugurubripes）TLR14的亲缘关系最近。2.东北七鳃鳗TLR基因组织表达分析：利用获得的东北七鳃鳗TLR基因的cDNA序列，设计定量引物，荧光定量PCR的结果显示，TLR基因在健康东北七鳃鳗幼鱼和成鱼所检测的组织中均有表达。4个TLR基因在幼鱼的心中均有最高的表达量；TLR7b、TLR14d在成鱼的脑中均有最高的表达量。除此之外，这4个TLR基因均在免疫相关组织中有较高的表达量，如脂肪体、肝、皮肤等。荧光定量PCR分析TLR基因在铜绿假单胞菌刺激后的表达量变化，结果显示，TLR基

7、因可以被细菌诱导表达，但是不同组织在不同时间点的表达情况不同，TLR7a表达量在脂肪体、鳃、肠、肾中显著上调；TLR7b表达量在脂肪体和肾中显著上调；TLR14d表达量在脂肪体、鳃、肾中显著上调；TLR2dI上海海洋大学硕士学位论文表达量在脂肪体、鳃、肾中显著上调，但是在肠中显著下调。3.东北七鳃鳗TLR基因亚细胞定位：将pCMV-TLR重组质粒转染HEK293T细胞，观察其在细胞中的定位情况。结果表明，TLR14d定位于细胞的细胞核和细胞质及多个细胞器中；TLR2d定位于细胞的