三种菌ampg基因的结构及遗传互补功能研究

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1、温州医学院硕士学位论文答辩委员会主席：芒态熬援逝江太堂答辩委员会成员：韭匾菱塾援漫丛医型太堂塍蕉主任湿趔直主!坠医院篚自田量!』塾握遏趔医型太堂迕塞副塾握显趔医型太堂论文答辩日期：温州医学院硕士学位论文目录缩略词表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯-2中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯-3英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯-5前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯-11实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯26分析与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

2、⋯33结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．-36参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯37致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·39综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·-40参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯52独创性声明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯56温州医学院硕士学位论文缩略词表．2．温州医学院硕士学位论文三种菌鳓两基因的结构及遗传ri：},b功能研究中文摘要目的：通过对霍乱弧菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌的ampG基因参考序列和AmpG蛋白参考序列的整理，预测和分析其AmpG蛋白序列的保

3、守位点和跨膜片段，探讨不同菌属AmpG蛋白结构的多样性。将铜绿假单胞菌的ampG基因敲除，用鲍曼不动杆菌、霍乱弧菌和铜绿假单胞菌的ampG基因进行回补，通过比较回补前后菌属的表型改变，来研究不同菌属ampG基因的编码产物对AmpCl3．内酰胺酶的调控作用，从而为研制能抑$1JAmpG转运蛋白功能的药物和临床选择用药提供新的思路。方法：在NCBI数据库中搜索霍乱弧菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌的ampG基因序列和AmpG蛋白序列，进行序列的对比分析，并对AmpG蛋白序列保守位点和跨膜区进行预测，分析AmpG蛋白结构的多样性。用PCR技术扩增鲍曼不动杆菌、霍乱弧菌和铜绿假单胞菌的ampG基

4、因，再进行分子克隆。通过基因回补实验，将三种细菌的ampG基因分别回补到铜绿假单胞菌(敲除了ampG基因)中。测定回补前后细菌AmpG蛋白表达量、Amp耐药浓度和AmpC酶的酶活性，通过对比，分析ampG基因的水平转移和变异规律，以及不同菌属来源的ampG基因对产AmpC酶系统的调控作用。’结果：1搜索到霍乱弧菌的57条AmpG蛋白序列，4条ampG基因序列，鲍曼不动杆菌13条AmpG蛋白序列，3条ampG基因序列，铜绿假单胞菌PA01的5条AmpG蛋白序列，2条ampG基因序列，通过对比分析和整理各得到一条参考序列。2将霍乱弧菌、鲍曼不动杆菌AmpG氨基酸参考序列分别与铜绿假单胞菌P

5、A01(PA4393)进行比对，发现霍乱弧菌与铜绿假单胞菌PA01(PA4393)AmpG氨基酸序列相似度为75％，而鲍曼不动杆菌与铜绿假单胞菌PA01(PA4393)AmpG氨基酸序列相似度为64％。3用PRED．TMR软件分别对霍乱弧菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌PA01的AmpG蛋白进行跨膜结构分析。分析结果表明，霍乱弧菌的AmpG蛋白有10个跨膜片段，而鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌PA01的AmpG蛋白分别有11，13个跨膜片段。4在基因回补实验中，用霍乱弧菌ampG基因回补到敲除了ampG基因的铜绿温州医学院硕士学位论文假单胞菌PA01后，Amp．MIC值由回补前的6499／m

6、l升为512p．g／ml，用鲍曼不动杆菌ampG基因回补后，Amp．MIC值由6499／ml升为102499／ml，用铜绿假单胞菌的ampG基因回补后，Amp—MIC值由6499／ml升为102499／ml。5在AmpC酶的诱导实验中，敲除了ampG基因的铜绿假单胞菌PA01用抗生素诱导后AmpC酶的酶活性由诱导前的35．49只升到44．82。而未敲除ampG基因的铜绿假单胞菌PA01AmpC酶的酶活性由诱导前的112．4升到1981．64，用霍乱弧菌的ampG基因回补后，AmpC酶的酶活性从诱导前的24．4升到5063．64，用鲍曼不动杆菌的ampG基因回补后，AmpC酶的酶活性从诱

7、导前的49．48升到6800．35，用铜绿假单胞菌的ampG基因回补后，AmpC酶的酶活性从诱导前的37．87升到5019．31。结论：通过对霍乱弧菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌PA01的AmpG蛋白序列的对比分析，发现不同菌属的AmpG蛋白序列和跨膜片段不完全相同，具有多态性。但AmpG蛋白作为一种跨膜蛋白，其氨基酸序列具有一定的相似性，有一些相同的疏水性氨基酸的保守位点，这说明不同菌属的AmpG蛋白虽然有多态性，但其结构和跨膜转运功能有一定