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1、第37卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第4期2009年4月ChineseJournalofAnalyticalChemistry527～531免疫化学方法测定动物组织中呋喃唑酮残留标示物3112常超伍金娥袁宗辉1(武汉工业学院食品科学与工程学院,武汉430023)2(华中农业大学国家兽药残留基准实验室/农业部食品安全评价重点开放实验室,武汉430070)摘要以自制特异性抗体为核心试剂,建立了以苯甲醛为衍生试剂的呋喃唑酮残留标示物间接竞争ELISA方法。通过方阵滴定法和间接竞争法确定ELISA方法最佳反应条件:抗原最佳包被浓度200μg/L,抗体最佳5稀释倍数1∶2.5×10,抗体与
2、药物最佳工作配比40μL∶60μL,最佳竞争时间1h。检出限为0.1μg/L,检测范围0.1～25.6μg/L,线性关系良好。在空白组织中(猪肌肉、猪肝脏、鸡肌肉、鸡肝脏、鱼肉)添加0.4、1.0和5.0μg/kgAOZ,回收率55.8%～96.6%,相对标准偏差均小于20%。测定20份不同组织的空白样品,方法的检出限为0.4～0.5μg/kg。以100mg/kg呋喃唑酮饲喂动物,其组织样品同时经HPLC方法和本方法测定,数据表明本方法具有实际检出能力,测定结果与仪器方法的测定结果相近。通过与德国同类试剂盒比较实验表明,本方法的灵敏度、精密度、准确度接近于进口试剂盒水平,可用于动物可食性组织肝
3、脏和肌肉中AOZ筛选。关键词呋喃唑酮,32氨基222恶唑烷酮,免疫分析,动物组织,残留1引言呋喃唑酮属于硝基呋喃类抗菌药,常用于防治畜禽肠道感染。据毒理学研究发现,呋喃唑酮具有较[1,2][3]强的致癌、致畸、致突变作用,欧盟、美国、中国等均禁止在畜禽生产中使用。但由于呋喃唑酮抗菌效果良好,仍有滥用现象,残留超标事件时有发生。因此开发灵敏高效的呋喃唑酮残留的检测方法具有重要意义。[4,5]呋喃唑酮在体内很快代谢成32氨基222恶唑烷酮(AOZ),且存留较长时间,被视为残留标示物。检测AOZ时,通常先将AOZ从组织解离出来,再与衍生试剂22硝基苯甲醛生成32(22硝基苯亚甲基)2氨基222恶唑烷
4、酮(NPAOZ),通过检测NPAOZ达到检测AOZ的目的。目前检测AOZ残留的方法有[6][7][8]LC2UV、LC2MS和LC2MS2MS,我国检测呋喃唑酮标准主要有HPLC(SC/T302222004)、HPLC2MS[9](GB/T18932.2422005)。该类技术所需设备要求较高,不适合高通量样品筛选。酶联免疫吸附法(ELISA)具有灵敏度高、特异性好、成本低等特点,适于高通量样品筛选。德国Bio2pharm公司研发出[10,11]AOZ酶联免疫试剂盒,其检测仍要将AOZ衍生成NPAOZ。目前,中国没有建立酶联免疫快速筛选方法,国内所用试剂盒主要依靠国外进口。因此,我国急需建立快
5、速筛选呋喃唑酮的ELISA方法。本研究以本实验室制备的AOZ特异性抗体(特异捕获AOZ与苯甲醛的衍生物N2苯亚甲基232氨基222恶唑烷酮,PAOZ)为基础,建立了呋喃唑酮残留标示物ELISA方法,检测目标化合物为PAOZ,具有一定的创新性和重要的经济价值。2实验部分2.1试剂、仪器及实验动物AOZ、PAOZ、AOZ特异性抗体(华中农业大学国家兽药残留基准实验室);HRP2羊抗兔IgG(Pierce);卵清蛋白(Sigma公司);呋喃唑酮(山东金泰集团股份有限公司);苯甲醛(上海化学试剂公TM司);德国AOZ检测试剂盒(Bio2pharm);OasisMAX固相萃取柱(Waters公司);其它
6、试剂均为AR级。高效液相色谱仪(Agilenthp1100series型);酶标仪(SUNRISEMagenllanCE2.5型)。长大二元杂交去2008207228收稿;2008210228接受本文系“十一五”国家食品安全重大科技专项(No.2001BA804A18201)资助3E2mail:changchao2000@yahoo.com.cn528分析化学第37卷势仔猪,45日龄,体重(15.0±2.0)kg,购于华中农大试验猪场;鸡肉、鸡肝、鱼购于超市。2.2实验方法2.2.1间接竞争ELISA用包被缓冲液将包被抗原(改造半抗原与卵清蛋白偶联物)稀释至适当的工作浓度,每孔100μL,置于
7、4℃12h;洗涤后用1%的卵清蛋白37℃封闭1h,加入系列浓度药物(PAOZ)标准品60μL和药物抗体(特异捕获PAOZ)40μL,37℃湿盒放置1h,洗涤后每孔加入100μL1:10000的HRP2羊抗兔IgG,置37℃湿盒1h,洗涤后每孔加入新鲜配制的底物溶液,置于37℃显色[12]10～15min后,每孔加入50μL的终止液,于450nm测定各孔的吸光值。2.2.2ELISA最佳反应条件优化
