葡萄1--氨基环丙烷--1--羧酸合酶基因的克隆和表达分析

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1、分类号：密级：学校代码：10165学号：201111217遣掌师耗大学硕士学位论文@葡萄卜氨基环丙烷-1-羧酸合酶基因的克隆和表达分析作者姓名：学科、专业：研究方向：导师姓名：初雪鹏遗传学植物发育与分子生物学侯和胜教授2014年03月学位论文独创性声明本人承诺：所呈交的学位论文是本人在导师指导下所取得的研究成果。论文中除特别加以标注和致谢的地方外，不包含他人和其他机构已经撰写或发表过的研究成果，其他同志的研究成果对本人的启示和所提供的帮助，均已在论文中做了明确的声明并表示谢意。学位论文作者签名：狂生!：鱼学位论文版权的使用授权书本学位论

2、文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规定，及学校有权保留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论文被查阅和借阅。本文授权辽宁师范大学，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库并进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。保密的学位论文在解密后使用本授权书。学位论文作⋯：避指删雠：j耋鲤签名日期：年月日辽宁师范大学硕士学位论文摘要ACC合成酶(1一氨基环丙烷一l一羧酸合酶，ACS)是植物乙烯合成中的关键酶。本研究以欧洲葡萄为材料，以ACS基因为研究对

3、象进行了研究，结果如下：1．对CTAB法、改良SDS法和Trizol法提取葡萄RNA进行了比较。结果表明CTAB法和改良SDS法都能提取到葡萄RNA。前者提取到的RNA质量好，无污染和降解；后者则产量高，但有蛋白质和DNA的污染，并有些降解；Trizol法无法提取获得葡萄RNA，可能是受试剂中胍盐的影响。利用CTAB法从不同组织中提取葡萄RNA，反转录后克隆得到VvACS3、VvACS4和VvACS53个基因。对这3个基因推导的氨基酸序列进行分析。结果表明：这3个基因均具有AAT-like保守结构域。且有多处能被磷酸化修饰的位点，说明了

4、VvACS在翻译后的修饰阶段易被磷酸化，可能与ACS活性有关。将实验室已克隆到的6个VvACS基因推导的氨基酸序列与番茄、拟南芥和玉米的ACS蛋白的氨基酸序列进行比对，并构建系统发生树。结果显示：这些VvACS具有不同程度的相似性和同源性。为进一步定性研究VvACS基因提供参考。2．对葡萄叶片进行乙烯、脱落酸处理和伤害诱导后，利用实时定量PCR对VvACS5基因相对表达量进行研究。发现外源乙烯和脱落酸都能先促进后抑制VvACS5的表达；伤害处理对M跚的表达具有促进作用。说明VvACS5能响应这些胁迫处理。这一发现初步证明ACS参与植物对

5、胁迫的调控。3．为进一步分析VvACS5基因的功能，构建了VvACS5基因植物双元表达载体，通过农杆菌介导转化拟南芥。本研究采用了浸花法进行转化。通过PCR方法和抗生素筛选初步验证，葡萄VvACS5基因成功的转到拟南芥基因组中。目前获得了7株VvACS5转基因拟南芥纯系植株。转基因拟南芥植株表现出叶片大，苗壮的特点，可能跟VvACS5的表达有关。对欧洲葡萄中ACS基因克隆、序列分析和功能分析等的研究，为阐明VvACS基因参与抗逆性调控的机制及其功能提供了重要的理论参考。关键词：葡萄；拟南芥；ACS基因；实时定量PCR；遗传转化葡萄卜氨基

6、环丙烷一卜羧酸合酶基因的克隆和表达分析Cloningandexpressionanalysisofgrape1-aminocyclopropane·-1··carboxylatesynthasegenesAbstractACS(1-aminocyclopropane-l—carboxylatesynthase)isoneofthekeyenzymesinethylenebiosynthesisandpathway．TheACSgenesof附括viniferawerestudiedinthisresearch．Theresultswer

7、easfollows：BycomparingthemethodsofCTAB，improvedSDSandTrizolwhicharecommonlyusedforextractingRNAs．wefoundthattheRNASofgrapecouldbeextractedbyboththeCTABandtheimprovedSDSmethods．High-quality．RNAswithoutproteincontaminationanddegradationwereobtainedbytheCTABmethod，whileahig

8、houtputofgrapeRNAscouldbeextractedwiththeproblemofdegradationandcontaminationsofproteinsandDNA．111egrap