结核分枝杆菌环介导等温扩增实时荧光与反向斑点杂交检测方法的研究

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1、中图分类号墅2墨!窆!结核分枝杆菌环介导等温扩增实时荧光与反向斑点杂交检测方法的研究计：学位论文：59页表格：5个插图：20幅指导教师：傅迎教授申请学位级别：硕士学位培养单位：大连医科大学金福姝学科(专业)：临床检验诊断学完成时间：二。一四年五月答辩委员会主席：独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在指导教师指导下进行的研究工作及所取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得大连医科大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己

2、在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字Et期：——年——月——日关于学位论文使用授权的说明本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权大连医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于(请在以下相应方框内打“√”)：1．保密口，在一年解密后适用本授权书。2．不保密口。作者签名：导师签名：日期：年月日日期：年月Et目录一、摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

3、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1(一)中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1(二)英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3二、正文⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯6(一)前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯6(一)日【『舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(二)材料和方法⋯⋯⋯．．：⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯22(三)结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯32(四)讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯43(五)结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯46(六)参考文献⋯⋯⋯⋯

4、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯47三、文献综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯52(一)综述正文⋯⋯⋯一⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．52(二)参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯56四、攻读学位期间发表文章情况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯．58五、致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯59大连医科大学硕士学位论文结核分枝杆菌环介导等温扩增实时荧光与反向斑点杂交检测方法的研究硕士生姓名：金福姝指导教师：傅迎教授指导小组：傅迎教授邹明强研究员(中国检验检疫科学研究院)专业名称：临床检验诊断学摘要结核病是一种

5、严重威胁人类健康的传染病，是我国重点防控的疾病之一，也是全世界重点关注的公共卫生和社会问题。据世界卫生组织(WHO)统计，全球目前约有860万人罹患结核病，130万人死于结核病。结核病的发病率以平均每年增加0．4％的速度增长。因此，寻找一种快速准确的结核分枝杆菌检测方法己刻不容缓。近年来兴起的环介导等温扩增技术具有快速、敏感性高、特异性强等优点，而反向斑点杂交技术结合了基因扩增与分子杂交两项技术，可准确、直观的观察结果，操作简便。本研究建立了结核分枝杆菌环介导等温扩增技术和反向斑点杂交技术，可以满足现场快速检测的需求，为结核病的防控提供了技术支持

6、。本研究分为四部分：第一部分：结核分枝杆菌插入序列IS6110基因的克隆与序列分析选择结核分枝杆菌特异性较好的插入序列IS6110片段作为靶序列，根据GenBank上公布的的结核分枝杆菌IS6110序列(GenBank登录号为：X17348．1)设计一对特异性引物。将PCR扩增后的目的片段与pGEM．T载体相连接，连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞，通过蓝白斑筛选得到克隆质粒pGEM．T-IS6110。克隆质粒经PCR及测序鉴定，结果证实获得了结核分枝杆菌IS6110基因。第二部分：结核分枝杆菌环介导等温扩增实时荧光检测方法的建立针对结核分枝杆菌特

7、有的插入序列IS6110，自行设计并合成结核分枝杆菌的大连医科大学硕士学位论文环介导等温扩增引物组(包括一对外引物以及一对内引物)，将引物组中的各引物按照一定的摩尔浓度比例配制成引物组溶液，并利用环介导等温扩增实时荧光检测系统建立结核分枝杆菌的环介导等温扩增检测方法，同时对内外引物摩尔浓度比例、反应温度进行优化得到最佳反应条件，结果通过环介导等温扩增实时荧光曲线进行分析。通过分析环介导等温扩增实时荧光曲线可知，整个反应用时lh，大多数反应在30min内开始扩增。同时，对10倍梯度稀释的结核分枝杆菌DNA模板进行检测，环介导等温扩增实时荧光检测方法

8、检测限可达2．4fg／反应，比PCR高100倍，对其他常见病原菌的DNA无检出，灵敏度和特异性均较好，具有广阔的临床应用前景。第三部分：