环介导等温扩增技术和实时聚合酶链反应检测痰结核分枝杆菌的优劣

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1、环介导等温扩增技术和实时聚合酶链反应检测痰结核分枝杆菌的优劣包维华（广西职业病防治研究院530021）【摘要】目的通过罗氏固体培养法，对环介导等温扩增技术（LAMP）和实时聚合酶链反应（RT-PCR）检测痰结核分枝杆菌的优劣评价。方法选择临床经罗氏固体培养为阳性痰标本68份，阴性标本68份，分别采用LAMP和RT-PCR方法进行结核分枝杆菌检测结果，两者阳性检出率分别为88.2%.85.3%,两者差异没有统计学意义（P〉0.05）;培养阳性标本经LAMP、RT—PCR检测结果灵敏度分别为91.2%和82.4%,两者差异没有统计学意义（P〉0.05）;培养阴性标本经LAMP、RT—PCR

2、检测结果的特异性分别为85.3%和88.2%,两者差异没有统计学意义（P〉0.05）。结论LAMP检测法阳性率高于RT-PCR法，但两者之间的差别尚无统计学意义,LAMP具有简单快速、准确,LAMP检测阳性标本灵敏度比RT-PCR好,LAMP检测阴性标本特异性稍低,LAMP具有简单、快速、准确，不需要昂贵的检验设备和严格的实验室设置，更适合棊层结核病的实验诊断推广应用。【关键词】PT-PCR技术LAMP技术结核分枝杆菌痰标本我国是全球结核病高发国家之一，位距世界第二位［1］。结核病实验室诊断是我国实施结核病防治规划的重要组成部分。一种准确及时，简单快速的肺结核诊断方法对早期切断结核病传

3、播，遏制结核病蔓延创造有利重要条件。结核病的诊断方法，目前主要是形态检验法，该法虽简单易行，但检出率低，不能特异鉴别是否结核分枝杆菌；分枝杆菌培养技术特异性、敏感性高，但耗时长，对及时诊断结核病和抗谤治疗错失良机。近年来，在聚合酶链反应（Polymerasechainreaction,PCR）基础上发展而来的环介导等温扩增法（loop-mediatedisothermalamplification,LAMP），是由日本荣研株式会社的Notomi等［2】于2000年开发出来的一种新型核酸扩增方法。LAMP反应不需要昂贵的设备，有着广泛的应用前景［3,4］。本研究采用LAMP技术和RT-P

4、CR（Real-time-PCR）方法对由常规培养鉴定为阳性和阴性痰样本进行检测结果评价。1材料与方法1.1标本收集收集2010年2月〜9月到结核病防治院门诊就诊的疑似肺结核患者痰标本并留取经罗氏固体培养基培养鉴定确认的阳性标本68份，阴性标本68份。1.2痰培养向痰标本加入4%naoH溶液处理20min,取0.1ml接种于酸性罗氏培养(BASO公司产品)斜面上，每份标本按2支培养基，置37°C培养箱培养4〜8周并记录培养结果。1.3DNA提取将液化后的痰标本混匀，在1.5ml离心管中移入0.5ml样本，15000rpm离心10分钟，弃去止清液，用无菌0.9%性理盐水1ml打匀，沉淀直

5、接加50mlDNA提取液充分混匀，沸水浴10分钟，lOOOOrpm离心5分钟，上清液为DNA模板。1.4LAMP扩增扩增反应体系由广州华峰生物科技有限公司提供。LAMP针对靶基因区域的4条特殊引扬的设计和具有链置换活性的Bst(BacillusStearothermophilus)DNA聚合酶的应用。将一定量的DNA模板加入反应管中，置干垫恒温仪内65°C反疲60min.反应结束后，试剂内的SYBRGreenI炎料结合，如有扩增产物，与染料结合而呈绿色，肉眼直接判读结果。1.5实时荧光核酸扩增(RT-PCR),试剂由广州达安基因股份冇限公司生产的结核分枝杆菌酸扩增荧光检测试剂盒，扩增仪

6、为广州达安因股份有限公司生产的实吋荧光核酸扩增仪(型号DA7600),按试剂盒方法进行检测。1.6统计学分析两方法检测结果差异的显著性检验用配对设计McNemarX2进行分析。2结果2.1LAMP和RT-PCR方法对痰标本的阳性检出率分别有LAMP和RT-PCR对痰标本标本进行检测，阳性检出率分别为88.2%(120/136)。85.3%(116/136)。结果显示LAMP法稍高。经显著性检验，两种试验方法对痰结核分枝杆菌的检测结果之间的差别无显著性意义(X2=0.409,P>0.05)，详细结果见表1，表2。表1LAMP、RT-PCR两种试验方法与培养法对痰结核分枝杆菌检测结果

7、2.2LAMP、RT-PCR检测结果的灵敏度和特异性培养阳性标本经LAMP、RT-PCR检测结果的灵敏度分别为91.2%(62/68)和82.4%(56/68)；LAMP检测结果灵敏度较RT-PCR高，但没冇统计学意义(x2=2.31,p〉0.05);培养阴性标本LAMP、RT-PCR检测结果特异性分别为83.3%(58/68)和88.2%(60/68)，LAMP检测结果比RT-PCR稍低，两者没有统计学意义(x2=0.257,p>0.0