野生型与缺失突变型hbx对肝细胞凋亡及microrna表达谱的影响

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1、中图分类号UDCR512．6610博士学位论文学校代码密级10533野生型与缺失突变型HBx对肝细胞凋亡及microRNA表达谱的影响TheapoptosisandmieroRNAexpressionprofilesofhepotocytestransfectedbywild-typeHBxandHBx-●·-·■deletionmutant作者、姓名：谢萍学科专业：临床医学研究方向：内科学(感染病学)学院(系、所)：中南大学湘雅医院指导教师：谭德明教授答辩委员会主席垃中南大学2013年4月原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的

2、研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：_牡日期：韭年』月卫日学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位

3、论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。作者签名：丘鲢牟导师签名奎丝弛期：型年二月里日野生型与缺失突变型HBx对肝细胞凋亡及microRNA表达谱的影响摘要：研究背景肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，大量流行病学调查表明，长期慢性乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)感染是导致HCC的主要病因。近年来研究发现乙型肝炎病毒X基因(hepatitisBvirusXgene，rmx)在HBV相关HCC的发生发展中发挥重要的作用。皿x能通过多种方

4、式影响肝细胞的凋亡，研究发现HBx对肝细胞凋亡的调节是船V引起HCC的重要机制之一，然而HBx对肝细胞凋亡过程的调节作用仍存在争议，其确切机制尚不清楚。有研究显示皿x-日、匕v-,促进细胞凋亡，但是也有研究显示HBx抑制细胞凋亡。有趣的是，一些研究发现在HBV相关的HCC组织中HBx基因常常发生缺失，尤其是羧基端的缺失。HBx羧基端的缺失可能改变了野生型HBx在控制细胞增殖、分化、凋亡方面的作用，从而在HBV相关HCC中发挥重要作用。我们前期的研究也显示，与野生型HBx相比，缺失突变型衄x能明显促进肝细胞的恶性转化，但其具体的分子机制尚有待阐明。微小

5、RNA(microRNA，miRNA)是一类在转录后水平调控基因表达的小分子RNA，参与发育、细胞增殖、分化、凋亡等多种生物学过程，在多种人类疾病包括肿瘤的发生中发挥着重要的作用。在肿瘤中miRNA表达的上调或下调可能起到癌基因或抑癌基因的作用。最近研究表明miRNA可能与HCC的发生与发展密切相关，但是miRNA在HBV相关HCC中的作用机制尚不十分清楚。研究目的通过对野生型HBx(HBx)和缺失突变型HBx(HBx．d382)真核表达载体转染肝细胞的生物学行为、细胞凋亡和microRNA表达谱的研究，探讨HBx与HBx．d382对肝细胞凋亡及mi

6、croRNA表达的影响，以及这些变化在肝细胞恶性转化中的作用。研究方法(1)复苏分别含pcDNA3．0、pcDNA3．0／HBx及pcDNA3．0／HBx．d382质粒的重组细菌DH．5a，提取质粒并用PCR、双酶切法鉴定质粒，对质粒进行DNA测序并应用DNASISMAX2．9、clusterW生物软件进行分析。(2)应用脂质体转染的方法，将质粒pcDNA3．0、pcDNA3．0／I-IBx和pcDNA3．0／HBx．d382转染入L02肝细胞中，用G418筛选出稳定表达HBx和HBx．d382蛋白的肝细胞株。(3)用放线菌素D(Actinomyci

7、nD，ActD)、肿瘤坏死因子a(tumornecrosisfactora，TNF．a)处理L02、L02／pcDNA3．0、L02／HBx和L02／Hx．d382组肝细胞，诱导肝细胞凋亡。用膜联蛋白V．异硫氰酸荧光素／碘化丙锭(AnnexinV．fluoresceinisothiocyanate／Propidiumiodium，AnnexinV．FITC／PI)双染色流式细胞分析法检测并比较ActD、TNF—a处理0小时，12小时，24小时，48小时各组肝细胞凋亡情况；用终末脱氧核糖核苷酸转移酶介导的原位缺口末端标ig(terminaldeoxyn

8、ucleotidyltransferasemediateddUTPnickendlabelling，TUNE